东菱迪芙和依达拉奉联合应用对大鼠急性期脑缺血损伤的研究

全银实,姜美子,金美善,崔玉珍,李香美,朱恩波

(1.丹东市第1医院 神经内科,辽宁 丹东 118000;2.延边大学附属医院 神经内科,吉林 延吉 133000）

脑血管病是神经系统常见病和多发病,是目前人类疾病三大死亡原因之一。缺血性脑血管病占脑血管疾病的87%。急性期脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带组成。坏死区由于完全性缺血导致脑细胞死亡,但缺血半暗带仍存在侧支循环,尚有大量可存活的神经元,保护这些可逆性损伤神经元是急性期脑梗死治疗的关键。本次实验通过腹腔注射东陵迪芙与依达拉奉,观察大鼠局灶性脑缺血损伤前后hs-CRP及D-二聚体水平的变化及神经行为评分,阐明联合应用东菱迪芙与依达拉奉对急性脑缺血损伤的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

健康Wistar大鼠50只(体重200±50g）,由延边大学实验动物中心提供。大鼠分为正常组、脑缺血组、东菱迪芙组、依达拉奉组、联合用药组。用线栓法[1,2]制作大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,依达拉奉注射液(吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司）,东菱迪芙注射液(北京托毕西药业有限公司）、hs-CRP试剂盒(德国罗氏诊断有限公司）,）D-二聚体试剂盒(日本东亚希森美康公司）,尼龙线(东莞市佳合线带厂）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑缺血模型的制作 用线栓法制作大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。用10%水合氯醛(3 ml/1 kg）腹腔注射,约5 min后开始麻醉起效,持续时间约1.5h。仰卧位固定,术区用碘伏消毒。沿颈部正中线切开皮肤,钝性剥离颌下腺,在左侧的肩胛骨舌骨肌、胸骨舌骨肌之间用眼科用镊钝性剥离出左侧颈总动脉(common carotid artery,CCA）及其分支颈外动脉(external carotid artery,ECA）和颈内动脉(internal carotid artery,ICA）,避免损伤迷走神经、气管和颌下腺体背面的静脉窦。首先用6—0缝合线结扎颈总动脉分叉处下方约1cm处,将颈外动脉在分支出枕动脉和甲状腺上动脉处以6—0缝合线结扎,游离出ECA主干;分离出ICA并穿一套线。解剖显微镜下用眼科剪在CCA接近ECA与ICA分叉处剪一小口,将尼龙线栓(尼龙线前端涂上一层硅树脂,使其变粗,直径0.25-0.30 mm）[1,2]沿切口插入至颈内动脉约18 mm左右[3,4],当感到阻力时向后退回约1 mm,此时线栓头端已通过大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion reperfusion,MCA）根部,阻断了左侧MCA血流。用6—0缝合线结扎颈内动脉,剪断血管外的线栓。将颌下腺归位,缝合皮肤。脑缺血30分钟后腹腔内注射生理盐水3 ml/kg(A组）,脑缺血0.2 h后腹腔内注射东菱迪芙4 BU/kg(B组、D组）,脑缺血0.5 h、6 h后腹腔内注射依达拉奉3 mg/kg/次(C组、D组）。

1.2.2 神经功能评分 缺血2 h,24 h后按照Longa EZ[1]法进行神经行为评分。0分:无神经损伤体征;1分:不能充分伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾斜;4分:不能自主行走,意识丧失。

1.2.3 猝死大鼠及测定hs-CRP及D-二聚体 脑缺血24 h后用10%水合氯醛(3 ml/kg）腹腔注射,约5 min后剖胸,用5 ml注射器刺入左心室,抽新鲜血5 ml左右。常规方法采用CA7000全自动血凝分析仪进行D-二聚体定量检测。hs—CRP浓度采用免疫比浊法,用全自动生化仪测定,严格按试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示,组间采t检验比较,P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为评分

见表1。

表1 Wista大鼠的神经行为评分(±s,n=10）

表1 Wista大鼠的神经行为评分(±s,n=10）

注 ▲与脑缺血组比较有统计学差异(P＜0.05）,●与依达拉奉组比较有统计学差异(P＜0.05）,★与东菱迪芙组比较有统计学差异(P＜0.05）。

组别 缺血2 h后 缺血24 h后脑缺血组(B组） 2.70±0.95 2.90±0.73东菱迪芙组(C组） 2.20±1.03▲ 1.40±0.84▲●依达拉奉组(D组） 2.50±1.08 2.10±0.99▲联合用药组(E组） 2.30±0.95▲ 1.00±1.05▲●★

2.2 Wista大鼠的血浆D-二聚体与血清hs-CRP的测定

见表2。

表2 Wista大鼠的D-二聚体与 CRP测定(±s,n=10）

表2 Wista大鼠的D-二聚体与 CRP测定(±s,n=10）

注:▲与脑缺血组比较有统计学差异(P＜0.05）,●与依达拉奉组比较有统计学差异(P＜0.05）,★与东菱迪芙组比较有统计学差异(P＜0.05）。

D-二聚体(μ g/L） CRP(mg/L）A组 86.41±6.91 0.67±0.57 B组 2270.18±246.76 1.09±0.72 C组 389.37±40.84▲● 0.87±0.59 D组 569.89±96.91▲ 0.95±0.43 E组 284.20±26.90▲●★ 0.78±0.36

3 讨论

目前为止脑血管病导致的脑缺血损伤的机制除能量耗竭、兴奋性氨基酸(excitatory amino acids,EAA）毒性作用、梗死灶周围半暗带去极化外,还包括炎性细胞因子、一氧化氮(nitric oxide,NO）和自由基损伤及细胞凋亡等[5]。同时,机体也存在内在的自身保护机制,如血红素氧合酶(heme oxygenase,HO）作用产物及脑红蛋白(Ngb）的脑保护作用。急性期脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带组成[2]。坏死区因完全性缺血导致脑细胞死亡,但缺血半暗带仍存在侧支循环,尚有大量可存活的神经元。目前国内外研究人员从静脉溶栓治疗到介入微创治疗,力求恢复脑缺血区血液供应,保护受损神经细胞。但因“时间窗”的限制,实际上只有极少数患者能及时接受溶栓治疗,而且其带来的副作用再次给患者带来极大的痛苦,因此更有效、安全地保护这些可逆性损伤神经元是急性脑梗死治疗的关键。

本实验对急性脑缺血大鼠用东菱迪芙与依达拉奉处理后,进行神经行为评分及脑缺血损伤标记物D—二聚体的检测,证明了东菱迪芙通过降低纤维蛋白原降解产物D—二聚体水平,对急性脑梗死起神经元保护作用及改善神经症状。

东菱迪芙是丝氨酸蛋白酶的单成分制剂,为新型强力单成分溶血栓微循环制剂。具有降低血纤维蛋白原浓度,增强纤溶系统活性,改变血流流变学方面诸因素以及减少血栓形成等作用。依达拉奉作为一种新型的、强效的羟自由基清除剂及抗氧化剂,可抑制脂质过氧化反应,减轻脑水肿,也能防止氧化性细胞损害,减少缺血半暗带区的面积,抑制迟发性神经元损伤。依达拉奉血—脑屏障穿透率约60%,可在脑内达到有效治疗浓度。超敏C反应蛋白(hs-CRP）是应用新的技术检测的C反应蛋白(CRP）,在急性炎症或组织损伤、坏死时,IL—1和TNF—α可诱导IL—6的产生,而CRP基因转录主要受IL—6的调控,因此CRP浓度迅速上升。近期很多研究证明CRP与动脉粥样硬化斑块的形成,破裂及脱落有关,也有报道指出CRP是判断脑血管病患者病情及预后的指标。D-二聚体是纤溶酶水解纤维蛋白形成的特异性降解产物,它是由纤维蛋白原,可溶性和交联性纤维蛋白的共同降解而成。近年来,D-二聚体的定量检测已广泛应用于临床,检测D-二聚体的含量对肺栓塞,血栓性疾病,DIC及肿瘤等疾病诊断和治疗有重要意义,被视为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。血浆D-二聚体水平变化可作为判断急性脑梗死患者病情及评估预后的敏感标志物。

本实验研究发现对急性脑缺血损伤的大鼠用依达拉奉处理后,明显改善神经症状,降低脑缺血损伤标记物CRP与D—二聚体,证明依达拉奉对急性脑梗死起改善神经症状及脑保护作用。总之,观察体内D-二聚体的水平,根据测定结果,采取有效的防治措施,对降低ACI患者的发病率和死亡率具有十分重要的意义。本实验研究示,D-二聚体测定在脑缺血组显著高于正常组(P＜0.05）、脑缺血组显著高于依达拉奉组(P＜0.05）、依达拉奉组显著高于东菱迪芙组(P＜0.05）、东菱迪芙组显著高于联合用药组(P＜0.05）、联合用药组显著高于正常组。说明东菱迪芙与依达拉奉均可降低急性脑梗死D—二聚体水平,联合用药效果更佳,而且D—二聚体对大鼠脑缺血损伤是个敏感标记物。本次试验通过腹腔注射东陵迪芙与依达拉奉,观察大鼠局灶性脑缺血损伤前后血清hs-CRP及血浆D-二聚体水平的变化及神经行为评分,进一步证明东菱迪芙与依达拉奉对急性期脑缺血大鼠的脑保护作用,而且证明了联合应用东菱迪芙与依达拉奉,效果更显著。

脑缺血损伤严重危害人类生命及生活质量。随着研究发展,溶栓技术的不断改进和完善已解决了很多患者和医务人员的苦恼,但随之带来的副作用仍危及患者的生命。降纤治疗可间接起溶栓作用,其疗效安全、可靠,但其针对血栓的溶栓作用有待于进一步发展。不管是溶栓治疗,还是降纤治疗均是治疗急性期脑梗死的有效的治疗方案,但均对脑组织带来的再灌注损伤,因此,未来对脑缺血治疗的研究中,研究减少出血风险,延长溶栓治疗的时间窗是研究的重点,而且对损伤的神经元行保护治疗也是研究的关键。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1）:84.

[2]Laing RJ,Jakubowski J,Laing RW.Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Which method works best?[J]Stroke,1993,24(2）:294.

[3]Garcia JH.A reliable method to occlude a middle cerebral artery inWistar rats[J].Stroke,1993,24(9）:1423.

[4]Holland JP,Sydserff SG,Taylor WA,et al.Rat models of middle cerebral artery ischemia[J].Stroke,1993,24(9）:1423.

[5]安泳潼,夏玉叶,闵 吻.缺血性脑卒中的发病机制及其治疗[J].缺血性脑卒中的发病机制及其治疗进展,2010,01,35.