视网膜光感受器细胞外基质蛋白质SPACR的分离纯化

赵劲松,黄岚峰,王淑荣

(吉林大学第二医院 1.眼科医院 眼底病一科;2.骨科,吉林 长春 130041）

Interphotoreceptor matrix(IPM）是视网膜色素上皮细胞顶端和外界膜之间存在的细胞外基质,在视功能中很多生物学反应都是通过这个视细胞外间质起着重要作用,比如视色素转运,代谢产物的运输,细胞间信息交流,光感受器分化调节和排列等。IPM化学成分主要有透明质酸和蛋白质,其中分子量为150kDa的sialoprotein associated with cones and rods(SPACR）为主要蛋白质[1],迄今为止关于SPACR的研究尚不多。为进一步研究SPACR的功能,本文建立了从视网膜分离提纯SPACR蛋白的技术,期待为进一步研究SPACR活性、结构及功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物SPACR是不溶于PBS的蛋白质[1],取白来杭鸡视网膜,按照[1,2]获取白来杭鸡不溶于PBS的IPM成分。

1.2 试剂和仪器DEAE-Sephacel来自Amersham Biosciences,Sephacryl S-300 HR来自Amersham Biosciences,Mini-Protean II 2-D系统、SDS-PAGE电泳装置及电泳胶来自Bio-Rad。所有试剂均来自Bio-Rad公司和国产分析纯。SPACR抗体O46-F由日本Dr.Zako惠赠,其二抗peroxidase-conjugated protein A(1:3000）来自ICN.

1.3 缓冲液配制

1.3.1 组织裂解液配制 50 mM Tris-HCl pH 8.0,10 mM EDTA,1 mM PMSF,7 M urea,0.5%Triton X-100。

1.3.2 双向电泳上样缓冲液配制 1.6%Bio-lyte 5/7 ampholyte,0.4%Bio-lyte 3/10 ampholyte,9.5 M urea,2.0%Triton X-100,5%β-mercaptoethanol。

1.3.3 双向0.9×57-mm管状凝胶制作配方 Urea 5.5g,丙烯酰胺储存液(acrylamide）1.33ml,10%(w/v）Triton X-100 2ml,40%Bio-lyte 5/7 ampholyte 400 μ l,40%Bio-lyte 3/10 ampholyte 100 μ l,10%过硫酸铵(APS）10 μ l,N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED）10 μ l,加水至10 ml。(终浓度 9.2 Murea,4%acrylamide,2.0%Triton X-100,1.6%Bio-Lyte 5/7 ampholyte,and 0.4%Bio-Lyte 3/10 ampholyte,0.1%TEMED,0.01%APS）。

1.3.4 双向电泳平衡缓冲液 62.5 mMTris-HCl,pH 6.8,2.3%(w/v）SDS,5.0%(v/v）β--mercaptoethanol,10%(w/v）glycerol。

1.3.5 透析液 4M guanidinium chloride,0.5%Triton X-100,50 mM Tris-HCl pH 8.0。

1.4 方法

1.4.1 DEAE-Sephacel离子交换层析 颈部脱臼法处死白来杭鸡,在解剖显微镜下,冰上操作,按照Acharya[1,2]方法获取不溶于PBS的IPM成分作为粗提物,并重新溶于裂解缓冲液,4℃充分匀浆12 h,15000 rpm,4℃离心30 min,取上清液并上样于平衡过的DEAE—Sephacel离子交换柱(5 cm×50 cm）,上样后用初始缓冲液充分洗净未吸附的蛋白质,再用含有0.15-1M NaCl的缓冲溶液进行梯度洗脱并收集各组分,用紫外分光光度仪分别检测每管样品的A280值,并用Western blot法测定SPACR所在之处。

1.4.2 Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析 将DEAE-Sephacel离子交换层析洗脱下来含有目的蛋白质的吸收峰合并、浓缩,4℃条件下透析,用10 mM dithiothreitol 37℃还原30 min后上样于平衡过的Sephacryl S-300凝胶层析柱,收集各组分,于紫外分光光度仪分别检测每管样品的A280值,经浓缩后,用Western blot鉴定SPACR的分布。

1.4.3 双向电泳(two-dimensional electrophoresis）:分别取各组蛋白质样品20 μ g,加入上样缓冲液,混匀进行一向等电聚焦电泳。按下述步骤进行电泳:500V 10min,750V 4 h。电泳后取出胶条,置于平衡缓冲液中平衡10 min,将平衡好的胶条放入7.5%SDS—PAGE凝胶中,进行二向电泳,75V,20min,120 V直至溴酚蓝前沿距离玻璃板下缘0.5 cm处停止电泳,经电转膜,行考马斯亮蓝染色及Western blot免疫印迹。

1.4.4 蛋白质含量测定 蛋白质含量按Lowry法[3]和分光光度法进行测定,以牛血清白蛋白为标准样品。柱层析过程中的蛋白质检测用紫外分光光度计在280 nm下进行。

1.4.5 SDS-PAGE和Western blot免疫印迹 蛋白质样品加入上样缓冲液,混匀,95℃,5 min,加样于7.5%SDS-PAGE凝胶孔中,电泳后电转移至PVDF膜上,用10%脱脂牛奶封闭1 h,PBS洗涤后,加入O46-F孵育1h,PBS洗涤后加入peroxidase-conjugated protein A孵育1 h,PBS洗涤后,X线片显影、定影。

2 结果

2.1 DEAE-Sephacel离子交换层析结果

粗提物上样于DEAE离子交换层析柱后的洗脱曲线,可见两个洗脱峰(图1）,经 DEAE-Sephacel离子交换层析后部分杂蛋白被低离子强度的缓冲液洗脱下来,而第2个蛋白峰则在离子强度较强时被洗脱下来。经7.5%SDSP-PAGE电泳及western-blot分析显示SPACR在第2个蛋白峰内(图略）。

图1 DEAE离子交换层析柱的洗脱曲线

图2 Sephacry1 S-300 HR凝胶过滤层析的洗脱曲线

2.2 Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析结果

收集合并DEAE-Sephacel离子交换层析洗脱的第2个蛋白峰,上样于Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析,图2是经Sephacryl S-300 HR进一步纯化的洗脱曲线图,图中出现4个洗脱峰。蛋白质分子按分子大小被分离,大分子物质先被洗脱下来,小分子物质洗脱速度较慢。收集洗脱液,进行western-blot分析,发现SPACR在第2个洗脱峰(图略）。

2.3 各阶段的纯化效果

比较粗提蛋白液和经DEAE-Sephacel离子交换及Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析纯化后的蛋白样品的双向电泳结果,粗提溶液内蛋白质较多,分子量150 kDa处无明显蛋白质条带,而经过DEAE-Sephacel离子交换层析纯化后,蛋白质种类明显减少,再经过Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析纯化,双向电泳显示蛋白质得到进一步纯化,分子量150 kDa处有4个蛋白质点,经过western-blot验证表明与SPACR抗体反应(图3）。通过几种分离方法,我们得到了比较纯的SPACR。

图3 IPM粗提物(图A）经DEAE-Sephacel离子交换层析(图B）及 Sephacry1 S-300HR凝胶层析(图C）提纯后行双向电泳,并行考马斯亮蓝染色。图D为图C的样品同样经双向电泳后O46-F抗体免疫印迹结果。分子量标于图左侧,等电点标于图上方。

3 讨论

SPACR因为不溶于PBS,得到视网膜总蛋白后用PBS去掉可溶性蛋白质,即为粗提产物。根据SPACR的理化性质,我们采用DEAE-Sephacel离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶层析纯化SPACR。DEAE离子交换层析是利用一些带离子基团的纤维素,吸附交换带相反电荷的蛋白质。由于各种蛋白质的等电点不同,所带的电荷量不同,与纤维素结合的能力有差别。DEAE是一种阴离子交换剂,当蛋白质溶液通过DEAE柱时,带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸附,带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化SPACR时可选择pH值大于SPACR等电点的缓冲液,此时SPACR带负电荷,可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上,粗提物中的带正电荷的蛋白质不能被吸附而被去掉,然后用增加盐浓度的方法将结合的蛋白质按照结合力不同而分别洗脱下来,经SDS-PAGE检测,SPACR在离子强度较高条件下被洗脱下来。

凝胶层析是利用分子筛作用对蛋白质进行分离。凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质,经过适当的溶液平衡后,含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶层析柱时,大分子物质不易进入凝胶颗粒的微孔,只能分布于颗粒之间,因此在洗脱时向下移动的速度较快,最先被洗脱。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,洗脱时向下移动的速度较慢,随后被洗脱。因此,蛋白质分子按分子大小被分离。IPM的粗提物经过DEAE—Sephacel离子交换层析后,含有SPACR的样品再上样于Sephacryl S-300凝胶层析,SPACR分子量大约150kDa,属于大分子物质,不易进入凝胶颗粒的微孔中,而在凝胶颗粒之间移动,被先洗脱下来,这样可以分开SPACR和小分子物质。

双向电泳方法第一向为等电聚焦,基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同,在一个稳定、连续、线性pH梯度中进行蛋白质的分离。第二向为SDSPAGE,它是按蛋白质分子量的大小进行分离。通过双向电泳进一步分离出和SPACR分子量相差不多而等电点不同的蛋白质。

以上实验结果表明,DEAE—Sephacel离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶层析,选择适合的洗脱条件分离纯化SPACR可获得良好的效果。本研究建立了实验室分离纯化SPACR的技术参数和方法,具有较好的分辨率和重复性,为进一步进行视网膜蛋白质SPACR的研究奠定了基础。同时初步建立了视网膜蛋白质组双向电泳分析方法,具有较好的分辨率和重复性,本实验建立的技术也为进一步进行视网膜蛋白质组学研究奠定基础。

[1]Acharya S,Rodriguez IR,Moreira EF,et al.SPACR,a novel interphotoreceptormatrix glycoprotein in human retina that interacts with hyaluronan[J].J Biol Chem,1998,273(47）:31599.

[2]Acharya S,Rayborn ME,Hollyfield JG.Characterization of SPACR,a sialoprotein associated with cones and rods present in the interphotoreceptormatrix of the human retina:immunological and lectin binding analysis[J].Glycobiology,1998,8(10）:997.

[3]Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J Biol Chem,1951,193(1）:265.