亚麻韧皮纤维细胞发育分子生物学研究进展

李 翔 ，陈信波 ，邹 杰 ，龙松华 ，邓 欣

（1.湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；3.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205）

韧皮纤维产生于双子叶植物的韧皮部位，它的特点是纤维特别的长,纤维素含量高，木质素含量少以及次生细胞壁加厚。主要的韧皮纤维植物是麻类，例如亚麻、黄麻、苎麻、红麻、大麻等。韧皮纤维包括初生韧皮纤维和次生韧皮纤维。其中亚麻、苎麻、大麻初生韧皮纤维发达，主要利用的是初生韧皮纤维；黄麻和红麻利用的是次生韧皮纤维[1]。它们广泛应用于纺织，制造绳索，麻布，工业用厚布，包装材料等行业。亚麻是自然界三大纤维作物之一。其纤维具有拉力强、柔软、细度好等特点。亚麻属二倍体植物，具有基因组小（大约700 Mbp）、自花授粉、植株相对比较小等优势，作为韧皮纤维发育遗传和分子机理研究的模式植物。在分子水平上研究其发育规律有助于提高韧皮纤维的质量和产量。

亚麻纤维的质量与细胞壁的化学组成和结构相关。成熟的亚麻韧皮纤维组成成分主要为70%～75%的纤维素，15%的半纤维素，10%～15%的果胶以及1.5%～4.2%的H型木质素[2-3]。在发育成熟的韧皮纤维中，纤维素被含有β-半乳聚糖的非纤维素所覆盖包裹[4-5]。

1 亚麻韧皮纤维细胞发育

亚麻韧皮纤维主要为初生韧皮纤维，纤维束由12～40个纤维细胞组成。韧皮纤维细胞起源于顶端分生组织的原形成层产生的原生韧皮部中细胞质浓厚、较大的细胞，在发育过程中常出现多核[1]。随着植株生长，韧皮纤维细胞发育主要经历两个阶段：细胞伸长和次生细胞壁加厚。与棉纤维细胞这两个阶段发育不同，亚麻韧皮纤维细胞的这两个阶段是不重叠的[6-7]。

1.1 韧皮纤维细胞伸长

细胞伸长主要包括协同生长（coordinated growth）和侵入生长（intrusive growth），其中协同生长只持续几个小时，侵入生长持续2～4 d，每天伸长1～2 cm。单个纤维细胞伸长结束时可以达到平均33 mm的长度，这都是由侵入生长决定的。协同生长的细胞含有较少的基粒类囊体，核分裂是同步的，胞间连丝也是存在的。侵入生长时期的细胞含有较多的基粒类囊体，核分裂不同步，具有多核，没有胞间连丝，使得纤维发育成为独立的共质体区域[8]。植物细胞中，侵入生长主要有两种形式：顶端生长（tip growth）和扩散生长（surface/diffusive growth）。亚麻韧皮纤维细胞的侵入生长在很长一段时间被认为是顶端生长模式，然而Gorshkova等[9]由放射自显影标记结果得出的结论是亚麻韧皮纤维细胞伸长主要表现为扩散生长，而不是顶端生长。这个结论也由Ageeva等[10]通过微管蛋白免疫标记，电子显微镜和光学显微镜等实验得以证实。

1.2 韧皮纤维细胞次生壁加厚

植株进入快速生长期时，出现分界点（the snap point），分界点以上的细胞停止伸长，分界点以下的细胞就进行细胞壁加厚[11]。随着植株的生长，分界点沿着茎向上移，当茎的发育完成，进入开花期（一般在发芽7周后），分界点消失。次生细胞壁加厚与纤维素沉积息息相关，纤维素的沉积量决定细胞壁厚度，韧皮纤维品质也是由这个阶段决定的。纤维束外部细胞的次生细胞壁先加厚，加厚的过程一般持续2个月左右，纤维束各细胞细胞壁在横截面上的加厚程度差异很小。与其它类型细胞的细胞壁只有0.1～1.0μm不同，成熟的韧皮纤维细胞壁能达到10μm以上。这个时期，半乳糖体自由基含量很高（14mM），是细胞侵入生长伸长时的13～20倍。β-半乳糖苷酶活性也很高，它以组织阶段特异性的β-1,4半乳糖体为底物[12]。可溶性高分子量半乳聚糖以及其特异的高尔基体囊泡在整个细胞伸长时期是不存在的，而是在早期的细胞壁加厚时期开始积累，纤维成熟时期消失[13]。

Girault等[14]通过Yariv试剂在次生细胞壁中观察到含量比较丰富的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）以及其定位，推测次生细胞壁沉积方式是按照圆形环状循环排列的。AGP骨架主要是由谷氨酸，天冬氨酸，丝氨酸，丙氨酸，甘氨酸和苏氨酸组成，缺少羟脯氨酸。Hotte等[15]通过质谱法和双向电泳检测亚麻韧皮纤维细胞次生壁发育早期抽提的蛋白质组，发现钾离子通道亚基，钙磷脂结合蛋白，膜孔蛋白，分泌途径组件，β-淀粉酶，β-半乳糖苷酶以及果胶和半乳糖合成酶的含量很高。这些都与之前用组织和生物化学手段研究旺盛的次生细胞壁沉积过程相一致，特别是重要的半乳聚糖和分泌蛋白[13]。大量的β-淀粉酶的存在，可推测出淀粉可能是亚麻韧皮纤维细胞壁的原始材料。钙磷脂蛋白在纤维发育过程中，可能与纤维素的合成有关。热激蛋白HSP60，HSP70，HSP90 含量也很高[15]，推测其与细胞内蛋白质折叠，蛋白质运输到线粒体和叶绿体有关。特别是HSP70，可能与亚麻纤维次生细胞壁沉积过程中质膜形成有关。

2 纤维特异性半乳聚糖和高尔基体在次生细胞壁加厚中的作用

纤维特异性半乳糖体在亚麻纤维细胞发育过程中担任着重要的角色。这种特异性半乳聚糖出现在次生细胞壁加厚时期，它大体（90%）是以鼠李糖为骨架，侧链由半乳糖体按照β-1,4连接构成，类似Ⅰ型聚鼠李半乳糖醛酸（RG-Ⅰ）聚合体。它们大多数都是短链，也有含28个半乳糖基的长链。其分子量在700～2 000 kDa范围之间，远远大于从成熟纤维细胞壁抽提出的半乳聚糖[16-18]。纤维成熟时，观察到两种类型结构的交联半乳聚糖，类似于可溶性半乳聚糖长侧链的C-L结构和短链的C-S结构。通过脉冲追踪实验得出，可溶性半乳聚糖固定在细胞壁上，导致半乳聚糖交联。它也能够使纤维素合成后结晶的时间延迟，这可能推测出其在纤维素微纤丝轴向取向中起着重要的作用[19]。

特异的半乳聚糖是通过特异的高尔基体囊泡分泌的。次生细胞壁形成阶段的高尔基体囊泡具有两种颜色（中间是暗的，周围是亮的），很容易与纤维细胞发育过程中其他组织或不同阶段的囊泡区别开来。许多这种特异性高尔基体囊泡互相融合在一起，形成大的液泡，最大直径可达4μm。最后，这种双色的囊泡和液泡与细胞质膜融合，以类似注射的方式，将囊泡里的内含物，如组织特异性的β-1,4半乳糖体释放到周质，在细胞壁的内侧表面形成暗带[8]。高尔基体囊泡的融合为细胞壁合成组装提供了充足的原料。特异性的半乳糖体被释放到大面积的周质中，能增加其与纤维素微纤丝相遇的机会，从而为细胞壁纤维素微纤丝轴向组装提供原料。

3 ESTs和基因芯片分析在亚麻韧皮纤维细胞发育中的研究进展

Day等[20]通过对亚麻开花期中期的韧皮纤维组织927条ESTs进行分析，发现4.4%的ESTs是与细胞壁形成和成熟相关的。其中表达量高的有β-木糖苷酶，纤维素合成酶（CesA），木葡聚糖核内转移/水解酶（XTH），β-半乳糖苷酶以及过氧化物酶基因。Roach等[21]对亚麻韧皮部cDNA文库分析得到一致的结果。CesA在开花期和绿熟期表达量高，这个时期是次生细胞壁进一步加厚，纤维素沉积，纤维逐渐成熟的时期。肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因在快速生长期表达量高于开花期，表明木质化始于这个时期。

Roach等在此基础上做了两个系列的基因芯片和qRT-PCR分析。在细胞伸长阶段，存在很多水通道蛋白和使细胞壁变松散的碳水化合物酶。水通道蛋白能调节细胞渗透压，当渗透压大的时候可以抑制协同生长。果胶酯酶能将细胞壁的果胶基质变得松散，XTH能改变木葡聚糖的结构以此适应细胞膨胀，这些都与细胞伸长有关。次生细胞壁加厚时期，蔗糖合成酶（SuSy）和果胶激酶含量丰富，纤维素合成酶就是以蔗糖合成酶合成的尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为底物，合成纤维素[22]。基因芯片和实时荧光定量PCR分析得出阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP），阿拉伯半乳聚糖成束蛋白家族（FLA）和脂质转移蛋白（LTPs）基因大量转录表达。在大麻韧皮纤维发育的基因芯片分析中也发现这三种蛋白基因的大量转录表达[23]。AGP与半乳聚糖的形成和纤维素微纤丝轴向取向有关。FLA蛋白家族在翻译后修饰比较多，通过对亚麻和富含凝胶纤维的白杨应拉木该基因的序列分析，发现其功能区域的保守性很强[24]。LTPs能提高细胞壁的伸展性，与纤维素合成有关，这些在烟草和棉花中得到证实[25-26]，推测这三类蛋白在韧皮纤维发育过程中起着重要作用。

4 展 望

韧皮纤维细胞发育是个复杂的过程，受很多基因表达调控影响。亚麻由于自身的优势可作为研究韧皮纤维发育和次生细胞壁形成的模式植物。由于包括亚麻在内的麻类基因组测序还未完成，很多与韧皮纤维细胞发育相关的基因功能尚未具体鉴定和阐述。但是随着亚麻韧皮部cDNA文库的建立，EST，基因芯片和蛋白质组分析的发展，可以从中选取与纤维发育相关的候选基因，进行基因功能鉴定，这将对研究韧皮纤维细胞发育的基因调控分子机理有很大的帮助。再加上近年来各种分子标记的开发[27]，可以进一步筛选出与纤维细胞发育相关的标记。利用分子标记辅助育种和基因工程技术培育出优良品质的亚麻韧皮纤维新品种也将指日可待。

[1] 庄馥萃.植物纤维和纤维植物 [J].生物学通报，2001，36（11）：16-18.

[2] Mooney C,Stolle-Smits T,Schols H,et al.Analysis of retted and non retted flax fibres by chemical and enzymaticmeans[J].Journal of Biotechnology,2001，89（2-3）：205-216.

[3] John S,Nilmini P,Amandeep S V,et al.A review of bast fibres and their composites：Part1 Fibres as reinforcements[J].Composites：Part A,2010,41（10）：1329-1335.

[4] Andeme O C,Girault R,His I,et al.Immunocytochemical characterization of early-developing flax fiber cellwalls[J].Protoplasma,2000,213（3-4）：235-245.

[5] His I,Andeme O C,Morvan C,et al.Microscopic studies on mature flax fibers embedded in LR white：immunogold localization of cell wall matrix polysaccharicles[J].Molecular Genetics and Genomics,2001,49（2）：1525-1535.

[6] 张 辉，汤文开，谭 新，等.棉纤维发育及其相关基因表达调控研究进展[J].植物学通报，2007，24（2）：127－133.

[7] Gorshkova T A,Ageeva M V,Chemikosova S B,et al.Tissuespecific processes during cell-wall formation in flax fiber[J].Plant Biosystems,2005,139（1）：88-92.

[8] Ageeva M V,Petrovska B,Kieft H,et al.Intrusive growth of flax phloem fibers is of intercalary type[J].Planta,2005,222（4）：565-574.

[9]Gorshkova T A,Morvan C.Secondary cell-wall assembly in flax phloem fibres：role of galactans[J].Planta,2006,223（2）：149-158.

[10]Mikshina P V,Chemikosova S B,Mokshina N E,et al.Free galactose and galactosidase activity in the course of flax fiber development[J].Russian Journal of Plant Physiology,2009,56（1）：67-77.

[11]Gorshkova T A,Salnikova V V,Chemikosova S B,et al.The snap point：a transition point in Linum usitatissimum bast fiber development[J].Industrial Crops and Products,2003,18（3）：213-221.

[12]Roach M,Deyholos M.Microarray Analysis of Developing Flax Hypocotyls Identifies Novel Transcripts Correlated with Specific Stages of Phloem Fibre Differentiation[J].Annals of Botany,2008,102（3）：317-330.

[13]Gorshkova T A,Chemikosova S B,Salnikov V V,et al.Occurrence of cell-specific galactan is coinciding with bast fibre developmental transition in flax[J].Ind Crops Products,2004,19（3）：217-224.

[14]Girault R,His I,Andeme O C,et al.Identification and partial characterization of proteins and proteoglycans encrusting the secondary cell-walls of flax fibres[J].Planta,2000,211（2）：256-264.

[15]Hotte N SC,DeyholosM K.A flax fibre proteome：identification proteins enriched in bast fibres[J].BMC Plant Biology,2008,8：52.

[16]Gurjanov O P,Gorshkova T A,Kabel M,et al.MALDI-TOFMS evidence for the linking of flax bast fibre galactan to rhamnogalacturonan backbone[J].Carbohydrate Polymers,2007,67（1）：86-96.

[17]Chernova T E,Guryanov O P,Brach N B,et al.Variability in the composition of tissue-specific galactan from flax fibers[J].Russian Journal of Plant Physiology,2007,54（6）：782-789.

[18]Morvan C,Ande`me O C,Girault R,et al.Building flax fibers：more than one brick in the wall[J].Plant Physiol.Biochem,2003,41（11-12）：935-944.

[19]Salnikov V V,Ageeva M V.Homofusion of Golgi secretory vesicles in flax phloem fibers during formation of the gelatinous secondary cellwall[J].Protoplasma,2008,233（3-4）：269-273.

[20]Day A,AddiM,Kim W,et al.ESTs from the fibre-bearing stem tissues of flax （Linum usitatissimum L.）：expression analyses of sequences related to cell wall development[J].Plant Biology,2005,7（1）：23-32.

[21]Roach M,Deyholos M.Microarray analysis of flax （Linum usitatissimum L.） stems identifies transcripts enriched in fibrebearing phloem tissues[J].Molecular Genetics and Genomics,2007,278（2）：149-165.

[22]Haigler C H,Ivanova D M,Hogan P S,et al.Carbon partitioning to cellulose synthesis[J].PlantMol Biol,2001,47（1-2）：29-51.

[23]De PM A,Vidmar JJ,Collins J,et al.Microarray analysis of bast fibre producing tissues of Cannabis sativa identifies transcripts associated with conserved and specialised processes of secondary wall development[J].Functional Plant Biology,2007,34（8）：737-749.

[24]Hobson N,Roach M,Deyholos M.Gene expression in tension wood and bast fibres[J].Russian Journal of Plant Physiology,2010,57（3）：321-327.

[25]Nieuwland J,Feron R,Huisman B,et al.Lipid transfer proteins enhance cell wall extension in tobacco[J].Plant Cell,2005,17（7）：2009-2019.

[26]Orford S J,Timmis J N.Expression of a lipid transfer protein gene family during cotton fibre development[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids,2000（2）,1483：275-284.

[27]Deng X,Long SH,He D F,et al.Development and characterization of polymorphic microsatellitemarkers in Linum usitatissmum[J].J.Plant Res,2010,123（1）：119-123.