有机磷农药的微生物降解技术

金 潇，颜冬云，秦文秀

（青岛大学化学化工与环境学院,山东 青岛 266071）

有机磷农药（Organophosphorus pesticides，Ops）是一种在环境中广泛使用的杀虫剂，具有高效、广谱等优点，自20世纪60年代以来，逐渐取代了有机氯农药。

随着有机磷农药的大量使用，其负面影响日益突出。残存于作物、土壤或水体中的有机磷农药，经物理迁移或化学转化，最终通过食物链的传递和富集作用影响人类及其他有益生物体[1]。1999~2001年，Abdel-Halim等[2]对一杀虫剂制造厂污水管道附近的污水、底泥和鱼类进行采样研究，结果表明，6份不同季节的样品中均存在毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪农、甲基嘧啶磷和溴丙磷。其中，毒死蜱在所有的水样和底泥样品中为主要污染物，浓度范围分别为 24.5～303.8 ng/L、0.9～303.8 ng/L，二嗪农在鱼类样品中为主要污染物。

有机磷农药的降解方式主要分为生物降解、光化学降解、化学降解等3种，其中微生物降解具有操作简单、成本低、代谢繁殖快，对污染物氧化完全，不会产生二次污染等优点[3-5]。为此，本文综述了有机磷农药微生物降解技术，以期为环境中有机磷农药的消解提供技术支撑。

1 降解菌种类

目前，人们已分离出多种能降解有机磷农药的微生物菌群，其中包括细菌、放线菌、真菌和一些藻类。

由于细菌具有生化多适应性及易诱发突变菌株等优势，故其在微生物降解中占有重要地位[6-7]。至今，已分离到的细菌主要有：假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属 （Baccillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、节杆菌属（Arthrobacter sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）等。金彬明等[8]从被有机磷污染的海水样中分离筛选出一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株，在28℃下对甲胺磷（5mg/L）的降解率达48.9%。解秀平等[9]从污水曝气池中分离得到一株能以甲基对硫磷及其降解中间产物对硝基苯酚为唯一碳源的节杆菌属（Arthrobacter sp.）菌株，在5 h内对50mg/L的甲基对硫磷和对硝基苯酚的降解率分别为85%和98%。

真菌因其高效的降解能力正逐渐引起人们的重视，主要有：曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、酵母菌等。颜世雷等[10]通过长期摇床驯化培养从污染土壤中筛选出两株可在高浓度氧化乐果环境下生长的曲霉菌株，在28℃时对氧化乐果的降解率分别为70.38%和61.28%。此外，某些藻类对有机磷农药也有一定的降解作用，如小球绿藻属（Chorolla）能降解对硫磷、甲拌磷等[11]，但这方面的研究相对较少。

2 降解菌获得途径

目前，获得可降解有机磷农药微生物的途径主要有 3种，如下。（1）从受污染的土壤、水体底泥、污水处理厂出口的污泥等受污染的环境介质中，进行筛选、驯化、富集和分离。王华等[12]采用室内培养方法，从长年施用乐果的土壤中分离筛选出一株能在高浓度乐果中生长的，且以乐果为唯一碳源的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株，该菌株对乐果的平均降解量为1 306.33 mg/L·60 h。廖金英等[13]从土壤中分离筛选出两株菌株，经鉴定分别为头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）和粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）。在甲胺磷浓度为500 mg/L，30℃，180 r/min摇床上基质培养72 h，对甲胺磷的降解率分别达到58.49%和65.80%。Zeinat等[14]从农业废水中分离筛选出5株以马拉硫磷为唯一碳源和磷源的细菌菌株，经鉴定，4株为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），1株为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。其中，苏云金芽孢杆菌在马拉硫磷的液体培养基上生长良好，经培养15 d后对马拉硫磷的降解率达91%以上。（2）定向培育优良菌种是近年来倍受关注的方法。该方法通过人为多次施药，在土壤中培育可降解该农药的微生物。如，刘文海等[15]从被甲胺磷废水污染的湖泊中分离细菌样品，以甲胺磷为唯一碳源和能源，经定向筛选，得到一株可高效降解甲胺磷的巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）菌株。气相色谱测定结果表明，此菌株对甲胺磷的降解率在48 h和96 h分别为49.24%和98.20%。（3）利用化学诱变剂或其他诱变方法获得新的降解菌。武晓炜等[16-17]通过紫外诱变育种从假单胞菌（Pseudomonas sp.）S-2中筛选出一株S-232。试验表明，S-232在30℃、摇床220 r/min的条件下，6d后，对甲胺磷的降解率达到74%，与菌株S-2的降解率相比，提高了8%～9%。

3 微生物降解机理研究

微生物对有机磷农药的降解方式可分两类。

一类是微生物直接作用于有机磷农药[18]，其实质是酶促反应，包括氧化、脱氢、还原、水解、合成等作用，主要是微生物本身含有可降解该农药的酶系基因。或者，虽然微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系[19]，但在农药胁迫下，微生物的基因发生重组或改变，产生了新的降解酶系。Mageong等[20]报道大肠杆菌产生的磷酸三酯酶能打开P=S键。路杨等[21]分离出的菌株可以不同程度地打断甲胺磷中的P=N键、P=O和P=S键，完全转化为PO43-。阮少江[22]研究发现，甲胺磷经甲胺脱氢酶（MADH）催化后，P=N键被打开脱氨基，同时可检出一定量的甲醇、PO43-和CH3SH。由此，他推测自然界中甲胺磷的降解很可能是从P=N的断裂开始的。对于微生物在其他种类有机磷上的降解方式，有不同的报道。Liu等[23]在分离到的抗辐射不动杆菌USTB-04降解甲基对硫磷的过程中，没有发现任何中间产物和最终产物。由此，他推测出USTB-04首先促使苯环上的C-C键发生断裂而非作用于P=O键。

另一类是微生物的活动改变了微环境功能而间接促使农药降解。常见的作用方式有3种。（1）矿化作用。其指微生物直接以有机磷农药作为生长基质，将其完全分解成无机物如CO2和H2O等的过程。石利利等[24]研究了假单胞菌DLL-1在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能、影响因素及其降解机理。结果表明，DLL-1菌能将甲基对硫磷完全转化为无机离子NO2-、NO3-，中间产物为对硝基苯酚。李晓慧[25]从长期受毒死蜱污染的污水处理池中分离到一株毒死蜱高效降解菌株，该菌株能在24 h内完全降解100mg/L的毒死蜱。（2）共代谢作用。其指微生物在有可利用碳源存在时，对原来不能利用的物质进行分解代谢的现象。艾涛等[26]分离到一株以共代谢方式降解乐果的真菌菌株L3，该菌株在120 h内对乐果的降解率达29.2%。王永杰等[27]从污泥中分离出一株以共代谢方式降解乐果的菌株G1，对乐果的降解率达60%以上。（3）种间协同代谢。指同一环境中的几种微生物联合代谢某种有机磷农药。在这种情况下，培养混合菌是一种可行的解决办法。对此，Douglas[28]曾做过尝试性研究。

4 影响微生物降解的因素

温度、pH值、农药初始浓度、微生物类型、外加碳氮源等因素均会影响微生物对有机磷农药的降解。

乔楠等[29]在研究废水中乐果降解菌的筛选及作用条件时发现，20~42℃，在一定pH值范围内，乐果都能被降解。其中，以pH值为7.0、30℃时的降解效果最好。此外，随着pH值的升高，降解率下降。仪美芹等[30]分离到3株能以甲基对硫磷为碳源和能源的真菌，包括2株木霉菌（Trichodermasp.）和1株链格孢菌（Alternariasp.）。在30℃左右，3株真菌都生长良好；低于10℃时生长缓慢，高于40℃生长受到抑制；在pH值为7时，3菌株的降解率最高。此外，他们还发现农药初始浓度对降解率有影响，菌株对有机磷农药浓度有一定的适应范围。秦坤等[31]分离筛选出3株能降解乐斯本的真菌，分别为土生曲霉组（Aspergillus terreus）、长梗串孢霉属（Monilochaetes）和烟色曲霉组（Aspergillus fumigatus）。这3株真菌均能以乐斯本为唯一碳源，5 d内对50 mg/L乐斯本的降解率分别达93.53%、91.37%、83.45%，且受初始浓度影响。随着外加碳源浓度的升高，这3种真菌的生长量都明显增加，但降解率降低，生长量与降解率不呈正相关关系。Anwar等[32]从污染土壤中筛选出一株高效降解毒死蜱及其代谢产物的短小芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）菌株C2A1。研究发现，C2A1在不同pH值、接种浓度、外加碳源和营养源以及毒死蜱不同浓度等培养条件下，菌株对毒死蜱的降解能力不同。吴春先[33]在探究环境条件和微生物对灭线磷降解的影响时发现，随着土壤含水量和温度的增加，灭线磷的降解速度加快，微生物对灭线磷的降解效果受到显著影响。在30℃、含水量为40%条件下，未灭菌土壤中灭线磷的半衰期为16.6 d，灭菌土壤中灭线磷的半衰期为31.6 d。有机质对灭线磷的降解也有显著影响，有机质含量高，有利于灭线磷的降解。此外，灭线磷在碱性土壤中的降解速度比在酸性土壤中的快。30℃、含水量为40%的条件下，灭线磷在3种土壤中的降解速度依次为：东北黑土＞广东红土＞山东砂壤土。Zhao等[34]从长期受甲胺磷污染的土壤中分离到一株真菌菌株ZHJ6草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），ZHJ6可以分别利用葡萄糖和甲胺磷为唯一碳源和氮源，还可以利用乙醇、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等为碳源和能源来降解甲胺磷。在无机盐培养基中，pH值5.0、25℃、1%的葡萄糖为菌株适宜降解条件。甲胺磷起始浓度为1.0×10-3mg/mL，培养12 d后，ZHJ6对甲胺磷的降解率达到99.9%。此外，ZHJ6在葡萄糖存在的条件下还可降解氧化乐果、辛硫磷、草甘磷，但不能降解毒死蜱、速灭磷、敌百虫、敌敌畏。因此，对其降解机理还有待深入研究。郑永良等[35]从长期受有机磷农药污染的土壤中分离到一株降解菌HS-A32，能以甲胺磷作为唯一的碳源和氮源。HS-A32菌降解甲胺磷的最适温度为30℃，最适pH值为7.0，最适降解浓度为1 000mg/L，降解率达82%。HS-A32菌能以多种碳、氮源生长，外加可利用的碳源和氮源能促进其对甲胺磷的降解。经鉴定，HS-A32为不动杆菌属（Acinetobacter），该菌还能降解甲基对硫磷等多种有机磷农药。刘玉焕等[36]利用选择性培养基从农药厂的废水流经地中分离到一株能高效降解乐果的丝状真菌，经鉴定为曲霉（Aspergillus），它能以乐果为唯一碳源和能源。在pH值7.0、30℃时，液体发酵120 h后，离心收集菌体处理的乐果，有机磷农药降解转化为无机磷的效率达87%，除Cu2+对菌株的降解率有促进作用外，金属络合剂（邻菲罗啉、联吡啶和EDTA）和其它实验中的金属离子如Ba2+、Al3+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Ag+、Hg2+、Fe3+、Cd2+、Li+对菌株的降解率有不同程度的抑制作用，对菌株的生长未产生明显的影响。此外，Cu2+对菌株的促进作用有浓度限制。

微生物对有机磷农药的降解受很多因素影响，且不同环境因素对微生物降解作用的影响差别很大。如何克服环境条件的影响，使微生物菌群对有机磷农药的降解发挥最大效能，是未来研究时需解决的关键问题之一。

5 微生物降解的广谱性

众多学者的研究表明，一种有机磷农药可以被多种微生物降解；同时，由于有机磷农药结构的相似性，一种微生物也可对多种有机磷农药进行降解，体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多样性。

有机磷农药种类繁多，在环境中往往不是单独存在的，因此人们希望找到一种能广谱性降解有机磷农药的微生物菌群。江玉姬等[37]从农药厂附近的土壤中分离、筛选到一株能高效降解MP、辛硫磷、三唑磷和敌敌畏的玫瑰单胞菌属细菌（Roseomonas），其对 MP、辛硫磷、三唑磷和敌敌畏的降解率分别为96%、99%、98.9%、69.0%。Kazufumi等[38]研究发现，节杆菌B-5可以降解异唑磷、二嗪农、对硫磷、苯硫磷、杀螟硫磷、异柳磷、毒死蜱、灭线磷等多种有机磷农药，降解速率因底物不同而异。其中，B-5降解异唑磷的能力最强，1 h内能完全降解浓度为10mg/L的异唑磷。刘玉焕等[36]采用富集、诱变分离方法成功获得一株高效降解有机磷农药乐果的真菌，它对其他有机磷农药的降解同样有效，如甲胺磷、马拉硫磷、对硫磷。这表明该菌株的降解特性具有广谱性。Liu等[39]分离纯化得到的青霉菌属BP303能够通过断裂P=O和P=S键来降解多种有机磷杀虫剂，如甲基对硫磷、对氧磷、蝇毒磷、内吸磷-s、亚胺硫磷和马拉硫磷等。

6 降解酶的固定化技术

固定化技术是近些年来兴起的一种对酶的处理技术，主要是应用物理或化学的方法使酶与不溶于水的大分子载体结合。与普通的游离酶相比，固定化酶在保持原有酶催化反应特性的同时，提高了稳定性，可以多次使用，应用前景广阔。

目前，国内外采用的酶固定化技术主要分为4种类型：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。郭军等[40]采用一种新型的聚集体交联酶固定化技术，对有机磷降解酶固定化酶的性质和应用形式进行了研究。结果表明，有机磷降解酶固定化酶的半衰期在70℃时比游离酶提高2.1倍。该学者所采用的酶固定化技术成效显著，有待深入分析。

7 基因工程菌的研究与应用

近年来，随着生物工程技术的发展，国内外研究者开始构建具有超强降解能力的基因工程菌，强化有机磷的降解。Wang等[41]通过基因工程使有机磷水解酶（OPH）基因在一株烟草植物中得到表达。烟草植物细胞在生长培养基上可以分泌出OPH并且对甲基对硫磷具有抗性。在培养14d之后，转基因植物对0.02%（v/v）甲基对硫磷的降解率达到99%。邓敏捷等[42]从产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）中克隆出有机磷降解酶基因ophc2，将其在大肠杆菌中诱导表达，并验证其生物学功能。酶学测定结果表明，经异丙基硫代β-D-半乳糖苷酶（IPTG）诱导4 h后，重组蛋白的酶活性是原菌的10倍。

8 结语

微生物降解有机磷农药具有广阔的应用前景，但目前主要研究成果是在实验室条件下完成的，其应用推广还有很大的局限性。未来关注的热点应主要集中在以下两方面：筛选高效有机磷降解菌，并通过基因工程菌的构建提高其降解效率；开发降解酶制剂产品，使有机磷农药的微生物降解技术得以商品化。

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