肿瘤基因治疗的研究进展

曹康，邹毅，彭延娟

（1.成都医学院病原生物学教研室，四川 成都 610083；2.广东省食品药品监督管理局审评认证中心，广东 广州 510080；3.成都医学院药理学教研室，四川 成都 610083）

肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。目前的治疗癌症的手段，比如化疗、放疗、手术治疗等等，可能会降低机体的免疫力，所以不能满意地达到限制肿瘤生长和扩散的效果［1］。而研究表明，肿瘤的发生、发展与基因的突变有关，可以说肿瘤是一种基因疾病。在各种物理和化学因素的作用下，原先正常的细胞中某些基因发生改变，比如原癌基因或是抑癌基因（tumor suppressor gene）突变导致细胞不停增殖，机体无法控制而导致肿瘤发生。此外，肿瘤细胞在生长过程中也会不断发生新的突变，这些突变可能导致肿瘤细胞对化疗药物失去敏感性。因此，迫切需要寻找新的途径来治疗肿瘤。

本世纪末，随着分子生物学的发展，随着DNA重组技术的成熟，基因治疗成为了一种新的治疗手段。基因治疗是目前肿瘤研究中一项重要的突破，基因治疗能刺激人体免疫力，来帮助机体识别肿瘤细胞并清除肿瘤细胞。基因治疗的原理是将外源性基因片段引入肿瘤细胞内使得肿瘤细胞中异常的基因得到控制，从而达到控制肿瘤的目的。肿瘤的基因治疗包括抑制癌基因和肿瘤多药耐药基因的表达、抑制血管生成、激活肿瘤抑制基因等等。近年来，随着基因治疗手段的不断发展，肿瘤基因治疗获得了长足的进步，逐渐成熟。很多肿瘤基因治疗的研究已经获得批准进入临床试验的阶段。目前，肿瘤基因治疗是肿瘤研究中非常有前景的领域之一。本文就肿瘤基因治疗常用的方法及载体等进行了综述。

1 肿瘤基因治疗常用的方式

1.1 导入抑癌基因

抑癌基因是指正常细胞本身就存在的一群基因，它们能够抑制细胞发生突变和向肿瘤发展。抑癌基因发生了突变，失去了对细胞生长的抑制作用，可以导致肿瘤的发生。细胞的DNA损伤可导致细胞DNA的突变，抑癌基因所编码的蛋白质就可以激活细胞凋亡的信号通路，使损伤的细胞发生凋亡。如果抑癌基因失活，那么DNA突变的细胞可以继续增殖从而导致癌变。研究发现，很多肿瘤患者都存在抑癌基因的失活，所以抑癌基因的失活与肿瘤的发生发展有着密切的关系。一种有效的方法是将抑癌基因导入肿瘤细胞，让抑癌基因在肿瘤细胞中表达、恢复细胞的正常生长表型、控制肿瘤细胞的生长速度、诱导肿瘤细胞出现凋亡，以达到治疗肿瘤的目的。现阶段研究比较多的抑癌基因有p53、APC、p16、RB、DCC基因等，其中以p53基因的应用最常见，很多以p53基因为靶点的治疗方案已进入临床试验或已经被批准用于临床。

p53基因是肿瘤基因治疗中最为常见的抑癌基因靶点，目前对p53这种抑癌基因研究最为深入。p53基因突变或者缺失是导致肿瘤发生的一个非常重要的因素，p53基因的突变会使它失去抑制肿瘤的功能，人类很多肿瘤中都有P53的突变。通过分子克隆技术将野生型p53基因转入到肿瘤的基因组，用以替换肿瘤细胞中已经发生突变的p53基因，到达控制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡。很多的体外和体内实验都表明，在肿瘤细胞中引入p53基因可以抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤的凋亡，效果比较明显。不过，单一的p53基因治疗肿瘤的临床试验虽然已获得较好效果。为了加强疗效可以将p53基因治疗联合其他疗法，比如化疗和放疗，或者联合细胞因子的基因治疗。使用p53基因的重组腺病毒（Adp53）对喉癌、肺癌、神经胶质瘤、乳腺癌和卵巢癌的治疗都有较好的效果，可以肿瘤体积缩小、肿瘤坏死和肿瘤细胞凋亡等［2－5］。

1.2 抑制癌基因的表达

癌基因是一类在正常细胞基因组中就存在的基因。它是维持机体正常生命活动所必须的基因，它的突变可能会导致细胞向恶性肿瘤转化。癌基因有其正常的生物学功能，它可以刺激细胞的生长和发育。在正常情况下，这类癌基因并不表达，或其表达水平很低，不足以引起细胞的病变。如果癌基因发生突变，会导致细胞的生长速度失去控制，无节制地促使细胞生长，保护这些细胞免于死亡，导致肿瘤的发生。现在可以通过使用分子生物学的技术将重组质粒或者病毒引入肿瘤细胞，表达出癌基因的反义RNA、或通过RNA干扰（RNAi）技术，以达到抑制癌基因表达的目的。目前癌基因治疗常见的靶点有RAS、survivin、c－myc等。这些基因在人类许多恶性肿瘤组织中都存在，是很有代表性的肿瘤基因［6－8］。

Survivin是一种新发现的抗凋亡基因，只在肿瘤组织中表达，而在正常的组织中不表达。其与肿瘤细胞的增殖、转移、耐药、复发等密切相关，目前认为Survivin是肿瘤治疗的一个理想靶点。近来有很多研究，使用Survivin的反义核苷酸及用RNAi的方法抑制Survivin的表达取得了良好的效果［9，10］。

1.3 自杀基因治疗

自杀基因又叫药物敏感基因，当在肿瘤细胞中导入自杀基因后，自杀基因编码的酶可以将对细胞无毒性的前体药物代谢转化成高浓度的毒性物质导致细胞死亡。自杀基因治疗方法的另一个好处是旁观者效应（bystander effect，BE），即不仅杀死已经导入自杀基因的肿瘤细胞，而且还可以杀死其周边的肿瘤细胞。其机制是通过血管或者细胞间的缝隙，将代谢出的毒性产物从导入自杀基因的肿瘤细胞中扩散到邻近的肿瘤组织，从而导致邻近肿瘤组织的凋亡［12］。

目前常用的自杀基因有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、细胞色素氧化酶P450基因等。细胞色素氧化酶P450能将环磷酰胺转化为磷酸胺氮芥从而发挥抗肿瘤的作用［11］。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因能将无毒的丙氧鸟苷磷酸化，转化为有毒的丙氧鸟苷三磷酸。有研究者使用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因作为靶点进行了多次临床实验，并取得了良好的效果［12，13］。

1.4 抑制血管生成

肿瘤的生长与转移需要足够的血液供应来提供营养物质和氧气。如果能干扰肿瘤血管生成就有可能控制肿瘤的生长，使肿瘤出现坏死、凋亡、萎缩。而肿瘤的血管生成要受到促血管生成和抑制血管生成的各种因子的共同调控，通过阻断促血管生长因子的表达或增强血管生长抑制因子的表达都可达到控制肿瘤血管生成的目的。内皮抑素（endostatin）和血管抑素（angiostatin）是肿瘤基因治疗中比较常见和有效的抑制血管生成的分子。内皮抑素和血管抑素能抑制血管内皮细胞的增殖，导致内皮细胞出现凋亡，从而抑制肿瘤血管的生成。目前有大量的报道证明内皮抑素和血管抑素基因治疗可以用于治疗肾癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌，能有效抑制肿瘤血管生成及控制肿瘤的生长［14－16］。

1.5 针对一些细胞因子的基因治疗

肿瘤的发生和发展与机体免疫系统对癌细胞的免疫耐受密切相关。原因可能是因为癌细胞的抗原性不强而不能刺激机体的免疫应答，或者是因为抗原递呈细胞不能提供足够的共刺激信号，或者是因为机体细胞因子分泌不足等原因。细胞因子在肿瘤生长过程中起了重要作用。某些细胞因子的释放，可以抑制肿瘤的发生与发展；而另一些细胞因子可以促进瘤细胞生长与增殖，加速肿瘤浸润和转移。可以将某些细胞因子的基因导入机体免疫活性细胞（如DC、TIL、LAK、细胞毒淋巴细胞和巨噬细胞细胞等）中来加强免疫系统对肿瘤细胞的识别和免疫反应能力。也可通过在肿瘤细胞中导入细胞因子受体基因的方法，让肿瘤细胞表面的细胞因子受体表达增加，增强机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和免疫杀死作用。目前的报道表明，如白细胞介素（IL）－1、IL－12、IL－3、IL－24、干扰素（IFN）－γ还有各种趋化因子等许多细胞因子都能增强机体对肿瘤的免疫能力［17－20］。

1.6 针对耐药基因的治疗

肿瘤细胞对化疗药物耐药是一个非常棘手的问题。有些肿瘤细胞对多种化学药物具有耐药性，化疗药物难以将其杀死，加大化疗药物使用剂量能将肿瘤消灭，但还有可能杀伤正常细胞从而出现副作用。耐药基因的存在是肿瘤细胞对化疗药物耐药的一个重要原因。耐药基因也叫化疗保护性基因，目前研究最多的是多药耐药基因（multidrug resistance，MDR）。它可以将进入细胞内的药物主动泵出细胞外，从而使肿瘤细胞免受化疗药物的杀伤。一方面，可以使用反义RNA技术或者RNAi技术，以抑制肿瘤细胞的多药耐药基因，从而逆转肿瘤细胞对化疗耐药性；另一方面，也可以通过向正常组织细胞导入耐药基因，以减轻化疗药物对正常组织的毒性作用，从而提高化疗的效果。目前有不少以多药耐药基因为靶点来治疗肿瘤的报道［21－23］。

1.7 肿瘤DNA疫苗

疫苗发展经过了3代，病原体的灭活疫苗和减毒活疫苗是第一代疫苗，亚单位疫苗是第二代疫苗，DNA疫苗是第三代疫苗。DNA疫苗是一项新的疫苗技术，出现于上世纪九十年代。研究发现直接肌肉和皮下注射流感病毒的裸DNA，可以使小鼠能出现细胞免疫和体液免疫，从而发明DNA疫苗［24］。近些年来，随着肿瘤基因的研究取得了非常大的进展，肿瘤的DNA疫苗也成为目前肿瘤基因治疗的一个重要手段。DNA疫苗的基本原理是：当在动物体内注入编码某种抗原的外源基因后，在动物细胞内的外源基因会表达出相应的蛋白质，动物体内的蛋白酶水解酶会将这些蛋白质分解成8～12氨基酸的多肽。这些多肽一部分被转运到内质网，在内质网与组织相容性复合物（MHC）－Ⅰ类分子结合，从而诱导CD8＋CTL的生成，出现细胞毒性T淋巴反应（CTL）。另外一部分多肽与MHC－Ⅱ类分子结合，从而诱导CD4＋Th2细胞产生体液免疫应答；而且还能诱导CD4＋Th1细胞产生各种细胞因子激活细胞和体液免疫。目前肿瘤DNA疫苗的研究已经进入了临床实验阶段。很多临床实验证明，DNA疫苗是一种安全有效的抗癌手段，高效而且费用低。

肿瘤DNA疫苗需要激活肿瘤细胞上的能引起微弱免疫反应的肿瘤抗原，肿瘤抗原分为两大类：肿瘤相关抗原和肿瘤特异抗原［25］。肿瘤相关抗原不只是由肿瘤细胞表达，在很多正常细胞中也有，如癌症－睾丸抗原，人类表皮生长因子受体／神经鞘膜蛋白，癌胚抗原［26］。目前研究者已经发现了很多肿瘤相关抗原，并用于肿瘤的基础研究与临床治疗。由于目前的生物技术发展迅速，新的肿瘤相关抗原还在不断地发现。不过，需要注意的是，肿瘤相关抗原在正常组织中也存在，所以DNA疫苗针对的靶点必须仔细选择以防止出现自身免疫。肿瘤特异抗原是由物理或者化学致癌物导致的突变造成的，它们只在肿瘤细胞中表达，如黑色素细胞／黑色素瘤差异抗原，酪氨酸酶，MART1，gp100，前列腺特异抗原（PSA）［27－29］。

2 肿瘤基因治疗相关载体

用于肿瘤基因治疗的生物类载体有病毒载体和非病毒载体等。病毒是一种非常简单非常原始的生命形式，病毒可以感染人或者动物，将其基因带入宿主细胞，在宿主细胞中复制与表达出病毒的蛋白质。通过基因工程手段可以将病毒的基因进行改造，将目的基因插入病毒的基因组，当病毒感染宿主后目的基因可以在宿主细胞中表达。病毒类载体最常见的有腺病毒、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。其他能作为载体病毒还有单纯疱疹病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒等等。病毒作为基因治疗的载体有靶向性好，转染效率高等特点，所以目前应用非常广泛，有些病毒载体已经进入临床实验阶段或已经被批准成药［30］。不过，病毒载体依然有安全性的问题；而且病毒具有免疫原性，再次感染有一定的困难。另外，病毒作为载体所携带外源基因的大小有一定的限制。非病毒性载体主要有脂质体转导系统，纳米粒材料等。非病毒性载体是一种安全性良好的载体。但是相比病毒载体，它的转染效率要低一些。非病毒载体制备较为简单，携带的外源基因的容量也比较大，而且保存与运输方便［31］。此外还有一些物理方法可以在基因治疗的给药中使用，比如电穿孔、基因枪、显微注射等，这些都是有效并有应用前景的方法。

3 前景与展望

基因治疗作为一种全新理念的治疗方法取得了非常大的成就。目前已经有多种基因治疗的产品已经批准上市或者进入临床实验阶段，比如编码p53基因的腺病毒产品已经在我国获批用于临床。肿瘤基因治疗虽然目前发展很快，但是还有很多问题没有解决。很多动物实验结果良好，但是在对于人体效果却不理想。有很多待解决问题，比如如何发现更加高效的载体、怎样增加基因治疗的靶向性、怎样发现更有效的基因靶点、怎样保证基因治疗的安全性等等。相信随着科学的进步，基因治疗手段的不断革新，肿瘤的基因治疗必将拥有更加广阔的应用前景。

［1］Varmus H.The new era in cancer research［J］.Science，2006，312（5777）：1162－1165.

［2］He X，Liu J，Yang C，et al.5／35fiber－modified conditionally replicative adenovirus armed with p53shows increased tumorsuppressing capacity to breast cancer cells［J］.Hum Gene Ther，2011，22（3）：283－292.

［3］Zhang Y，Shi Y，Li X，et al.Inhibition of the p53－MDM2 interaction by adenovirus delivery of ribosomal protein L23 stabilizes p53and induces cell cycle arrest and apoptosis in gastric cancer［J］.J Gene Med，2010，12（2）：147－156.

［4］Li Y，Li LJ，Zhang ST，et al.In vitro and clinical studies of gene therapy with recombinant human adenovirus－p53 injection for oral leukoplakia［J］.Clin Cancer Res，2009，15（21）：6724－6731.

［5］Idogawa M，Sasaki Y，Suzuki H，et al.A single recombinant adenovirus expressing p53and p21－targeting artificial microRNAs efficiently induces apoptosis in human cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2009，15（11）：3725－3732.

［6］Fei Q，Zhang H，Fu L，et al.Experimental cancer gene therapy by multiple anti－survivin hammerhead ribozymes［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2008，40（6）：466－477.

［7］Ulasov IV，Rivera AA，Sonabend AM，et al.Comparative evaluation of survivin，midkine and CXCR4promoters for transcriptional targeting of glioma gene therapy［J］.Cancer Biol Ther，2007，6（5）：679－685.

［8］Isayeva T，Ren C，Ponnazhagan S.Intraperitoneal gene therapy by rAAV provides long－term survival against epithelial ovarian cancer independently of survivin pathway［J］.Gene Ther，2007，14（2）：138－146.

［9］McMurtry MS，Archer SL，Altieri DC，et al.Gene therapy targeting survivin selectively induces pulmonary vascular apoptosis and reverses pulmonary arterial hypertension［J］.J Clin Invest，2005，115（6）：1479－1491.

［10］Mesri M，Wall NR，Li J，et al.Cancer gene therapy using a survivin mutant adenovirus［J］.J Clin Invest，2001，108（7）：981－990.

［11］Song X，Varker H，Eichelbaum M，et al.Treatment of lung cancer patients and concomitant use of drugs interacting with cytochrome P450isoenzymes.Lung Cancer，2011；74（1）：103－111.

［12］Federico C，Luisa B，Elisa F，et al.Combined HSV－TK／IL－2 gene therapy in patients with recurrent glioblastoma multiforme：biological and clinical results［J］.Cancer Gene Therapy，2005，12（10）：835－848.

［13］Palmer DH，Mautner V，Hull D，et al.Virus－directed enzyme prodrug therapy（VDEPT）：A clinical trial of adenovirusdelivered nitroreductase（NTR）in combination with CB1954in patients with primary or secondary liver cancer［J］.J Clin Oncol，2005，23（16）：31－57.

［14］Rocha FG，Chaves KC，Chammas R，et al.Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL－2in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59（9）：1357－1365.

［15］Liu LL，Smith MJ，Sun BS，et al.Combined IFN－gammaendostatin gene therapy and radiotherapy attenuates primary breast tumor growth and lung metastases via enhanced CTL and NK cell activation and attenuated tumor angiogenesis in a murine model［J］.Ann Surg Oncol，2009，16（5）：1403－1411.

［16］Martinico SC，Jezzard S，Sturt NJ，et al.Assessment of endostatin gene therapy for familial adenomatous polyposisrelated desmoid tumors［J］.Cancer Res，2006，66（16）：8233－8240.

［17］Zhao X，Bose A，Komita H，et al.Intratumoral IL－12gene therapy results in the crosspriming of Tc1cells reactive against tumor－associated stromal antigens［J］.Mol Ther，2011，19（4）：805－814.

［18］Suzuki R，Namai E，Oda Y，et al.Cancer gene therapy by IL－12gene delivery using liposomal bubbles and tumoral ultrasound exposure［J］.J Control Release，2010，142（2）：245－250.

［19］Inoue S，Shanker M，Miyahara R，et al.MDA－7／IL－24－based cancer gene therapy：translation from the laboratory to the clinic［J］.Curr Gene Ther，2006，6（1）：73－91.

［20］Mahasreshti PJ，Kataram M，Wu H，et al.Ovarian cancer targeted adenoviral－mediated mda－7／IL－24gene therapy［J］.Gynecol Oncol，2006，100（3）：521－532.

［21］Labialle S，Dayan G，Michaud M，et al.Gene therapy of the typical multidrug resistance phenotype of cancers：a new hope？［J］.Semin Oncol，2005，32（6）：583－590.

［22］Sugimoto Y，Aksentijevich I，Murray GJ，et al.Retroviral coexpression of a multidrug resistance gene（MDR1）and human alpha－galactosidase A for gene therapy of Fabry disease［J］.Hum Gene Ther，1995，6（7）：905－915.

［23］Licht T，Pastan I，Gottesman MM，et al.The multidrugresistance gene in gene therapy of cancer and hematopoietic disorders.Ann Hematol.1996，72（4）：184－193.

［24］Ulmer JB，Donnelly JJ，Parker SE，et al.Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein［J］.Science，1993，259（5102）：1745－1749.

［25］Stevenson FK，Rice J，Zhu D.Tumor vaccines［J］.Advances Immunol，2004，82：49－103.

［26］Caballero OL，Chen YT.Cancer／testis（CT）antigens：potential targets for immunotherapy［J］.Cancer Sci，2009，100（11）：2014－2021.

［27］Robbins PF，El－Gamil M，Kawakami Y，et al.Recognition of tyrosinase by tumor－infiltrating lymphocytes from a patient responding to immunotherapy［J］.Cancer Res，1994，54（12）：3124－3126.

［28］Kawakami Y，Eliyahu S，Delgado CH，et al.Cloning of the gene coding for a shared human melanoma antigen recognized by autologous T cells infiltrating into tumor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91（9）：3515－3519.

［29］Kawakami Y，Eliyahu S，Delgado XH，et al.Identification of a human melanoma antigen recognized by tumor－infiltrating lymphocytes associated with in vivo tumor rejection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91（14）：6458－6462.

［30］Fukazawa T，Matsuoka J，Yamatsuji T，et al.Adenovirusmediated cancer gene therapy and virotherapy.Int J Mol Med，2010，25（1）：3－10.

［31］Scanlon KJ. Cancer gene therapy： challenges and opportunities.Anticancer Res，2004，24（2A）：501－504.