血红蛋白在二氧化钛球腔阵列上的直接电化学研究

周 宇，周丽娟，孙 磊，尹 凡

（常熟理工学院 化学与材料工程学院，江苏 常熟 215500）

0 引 言

氧化还原蛋白在电极上的直接电化学研究对了解生命体系的能量转换和物质代谢，了解生物大分子的结构和物理化学性能的关系，探索蛋白质和酶等生物大分子在生命体内的生理作用和机制，开发新型的生物电化学传感器等方面的应用都具有重要的理论意义[1].

血红蛋白（Hb）是以血红素为辅基的蛋白质，由于具有重要的生理功能和典型的蛋白质化学结构且价格低廉，是研究酶和蛋白质直接电子转移的理想分子.Hb电活性中心血红素被包埋于肽链内部，并且直接吸附在电极表面的蛋白质易使固体电极表面钝化，导致Hb与电极直接交换电子较为困难，难以形成有效的电流响应信号，其电化学研究受到极大限制[2].为实现血红蛋白等酶蛋白质在电极表面发生可逆或准可逆的直接电子转移，许多研究者在电极表面修饰纳米金属[3]、纳米金属氧化物[4]、碳纳米管[5]等纳米材料活化Hb氧化还原中心，实现Hb在电极表面的电子传递，研究Hb在电极表面的直接电化学及在生物传感器方面的应用.

微电极由于具有纳米材料的表面效应、量子尺寸效应、量子隧道效应等优点，对酶电极的电子传递具有促进作用，并且在传质过程中，电活性物质从本体溶液到电极表面的扩散由平面扩散变为径向扩散，其传质情况获得了改善，电子传递速率加快；同时，由于微电极有效面积的减小也有效地降低充放电电流，从而提高电流信号的信噪比[6]，有效降低电化学的检测下限.微电极阵列由多支微电极并联组成，它很好地保持了微电极的特点，且可有效放大响应电流，可以在常规仪器上获得满意的电化学信号而受到越来越多的研究者关注.夏兴华[7]制备了纳米金球腔微电极阵列，研究Hb在纳米金球腔阵列上的直接电化学和对H2O2的电催化，池晓雷制备了氧化锌（ZnO）球腔微电极阵列，将Hb吸附在ZnO球腔阵列上制备了H2O2传感器.我们利用LB技术和溶胶-凝胶法制备二维有序TiO2球腔阵列，研究Hb在TiO2球腔阵列上的直接电化学及对H2O2的电催化性能.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

血红蛋白（Hb）购于Sigma公司.钛酸丁酯（Ti（OBu）4）、无水乙醇、乙酸乙酯、浓盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾购于上海国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯.ITO玻璃电阻小于100Ω（苏州板硝子电子有限公司）.实验中所用水均为二次蒸馏水.

Langmuir槽（612D型，英国NIMA）；2xz-2型旋片式真空泵（上海仪表集团供销公司）.

1.2 ITO电极的处理及PS小球阵列的制备

利用乳液聚合法制备PS微球，粒径约为1500nm.利用LB技术制备PS微球模板[8]，模板尺寸为0.5cm×0.4cm.

1.3 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极的制备

将0.2mL Ti（OBu）4+0.2mL HCl与12mL乙醇混合置于烧杯甲中超声振荡30min，将0.2mL水与12mL乙醇混合置于烧杯乙中超声振荡30min后，用滴管将混合液缓慢加入烧杯甲中，超声振荡30min，获得无色透明TiO2溶胶.

将PS小球阵列/ITO电极水平放置在制备好的TiO2溶胶液中，在真空干燥器中抽真空8min后，使小球与电极之间的空隙处于真空状态，当体系恢复正常压力时，前躯体溶胶填注到PS小球与电极之间的空隙内.取出修饰有TiO2溶胶的电极于室温中静置24h，溶胶在小球间隙结构中缓慢反应生成凝胶，用乙酸乙酯溶解掉PS微球，获得凝胶骨架结构.将电极于马弗炉中以5℃/min的升温速率升至500℃下恒温3h，随炉降至室温，得到“小碗”状TiO2球腔阵列/ITO电极（0.5×0.4cm）.

将3mg Hb溶于1mL磷酸盐缓冲溶液中（PBS，0.1mol/L，pH7.0），配成3g/L Hb溶液，取50μL Hb溶液直接滴加在TiO2球腔阵列表面，于4℃过夜，使其牢固吸附在TiO2球腔内部.未覆盖球腔阵列的ITO电极表面涂覆石蜡，以避免裸露ITO电极对阵列电极电化学测试的影响.

1.4 电化学测试方法

在CHI660c电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）上进行电化学测定.采用三电极电化学体系，以饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂片（2×7mm）电极为辅助电极，修饰ITO电极为工作电极（0.5×0.4cm）.测试溶液pH值均选用7.0.

2 结果与讨论

2.1 TiO2阵列制备原理

溶胶-凝胶法是通过金属-非金属醇盐[M（OR）n]的水解和缩聚反应来制备金属-非金属氧化物的，溶胶-凝胶法制备TiO2反应机理如下：

醇解反应

钛酸丁酯在水解的同时还进行以下缩聚反应，即发生了失醇水解和失水水解，如式（3）所示：

缩聚反应

最终形成的凝胶结构由式（3）决定.在溶胶向凝胶转变的后期，生成的TiO2溶胶分子相互之间进一步缩聚，并脱去H2O分子或醇分子构成三维网络状醇凝胶—（TiO2）n—[9].

将修饰有PS小球模板的ITO电极水平浸入溶胶中，通过在该电极表面施加负压，使小球与模板空隙中的空气排出.当体系恢复常压时，溶胶即填充到小球的空隙中.随着乙醇的挥发，溶胶即在空隙中形成凝胶.用乙酸乙酯溶去PS小球高温煅烧后即形成高度有序的TiO2球腔阵列.

2.2 TiO2球腔阵列的SEM表征及直接电化学

图1 TiO2球腔阵列SEM图

图1为TiO2球腔阵列的SEM图.由图可见，获得的TiO2球腔阵列二维有序性良好，呈“蜂巢”结构紧密排列，白色的TiO2球腔壁厚实饱满，形成稳定有序的球腔骨架结构，相邻球腔中心间距约1500nm，与PS小球的直径相当.这说明利用Langmuir技术制备的PS小球模板的二维有序性良好.将修饰有PS小球的ITO电极水平放置在TiO2溶胶液中抽真空，当回复到常压后，TiO2溶胶液被压入PS小球间隙中，溶胶依托PS小球间隙结构聚合交联形成凝胶，通过融蚀模板小球即能获得具有良好二维有序性的球腔阵列；同时只要变换PS小球尺寸，小球间隙尺寸也相应发生改变，从而能达到自由地控制球腔阵列尺寸的目的.

2.3 TiO2球腔阵列/ITO电极的电化学特性

TiO2球腔/ITO电极在含有0.1mol/L KCl的1mmol/L K3[Fe（CN）6]溶液中的CV曲线见图2（A）. 与裸ITO电极相比，TiO2球腔/ITO电极的氧化-还原峰电流明显减小，这是因为在ITO电极上修饰了一层致密的TiO2球腔阵列膜，它增大了探针分子[Fe（CN）6]3-/4-与ITO电极之间的电子传递阻力.TiO2球腔/ITO电极电阻的大小与凝胶层的厚度相关.TiO2是一种优良的半导体材料，由于受PS小球间隙结构的限域作用影响，TiO2球腔边缘处凝胶层最厚，底部的凝胶层最薄，因而球腔底部导电性最好，电化学反应优先在球腔底部发生.

与单个微电极的扩散方式不同，待测物质在TiO2球腔阵列上的扩散类型与扩散层厚度δ、相邻电极中心间距d、扫描速率v有关.TiO2球腔阵列扩散类型图见图2B.在扫描速率较低的情况下，δ较大，相邻电极之间的扩散层发生交叠，在此情况下，CV曲线出现峰型电流，且峰电流随扫描速率v的增加而变大.随着扫描速率的增大，δ逐渐变小，当δ≤d/2时，相邻电极的扩散层相互独立，待测物质在电极表面扩散类型为径向扩散，此时CV峰电流为各个微电极极限电流之和，在一定范围内，CV峰电流大小与扫描速率无关.随着扫描速率继续增大δ继续变小，当δ＜＜d/2时，待测物质在单个微电极上的扩散类型转变为线性扩散，此时CV曲线峰电流受扩散控制，随扫描速率的增加而变大[10，11].

通过不同扫描速率考察TiO2球腔/ITO电极的扩散类型（图2B），扫速由内到外分别为50mV/s、100 mV/s、150mV/s、200mV/s、250mV/s、300mV/s、350mV/s、400mV/s、450mV/s、500mV/s、700mV/s、1000mV/s. 当扫描速率低于100mV/s时，CV曲线开始出现常规电极的传统峰形，当扫描速率由50mV/s增大到100mV/s时，还原峰电流随扫描速率增大而增幅较大，这是由于TiO2球腔阵列中相邻微电极的扩散层发生扩散交叠所造成的，此时电极扩散类型为交叠的径向扩散.当扫描速率≥100mV/s时，CV曲线均为“S”形，还原峰电流随扫描速率增大变化不大.随着扫描速率的增大，扩散层厚度变小，此时相邻微电极的扩散层相互独立，扩散类型径向扩散，电子与电极之间传递速率最快，电极信噪比最大.当扫描速率＞500mV/s时，还原峰电流随扫速增大影响较大，扩散开始向线性扩散转变.因此，可认为TiO2球腔阵列/ITO电极具有微电极阵列的特性，但由于球腔的限域作用，球腔阵列的扩散和经典柱状微电极阵列的扩散略有不同，两者CV曲线也略有差别.

2.4 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极的直接电化学

图2 （A）不同电极的CV曲线，扫速100mV/s（B）TiO2球腔阵列扩散类型图（C）不同扫速下TiO2球腔阵列/ITO电极的CV曲线.溶液0.1mol/L KCl+1mmol/L K3[Fe（CN）6]

图3 不同电极在0.1mol/L PBS缓冲液（pH7.0）的CV曲线.扫描速率为100mV/s

在pH7.0的PBS溶液中采用CV法考察不同修饰电极上的直接电化学，见图3.由图可见，TiO2球腔阵列/ITO电极在PBS溶液中几乎无电化学响应.直接吸附Hb的ITO电极CV曲线无明显的氧化还原峰，这可能是因为Hb在ITO电极表面发生了吸附变性，阻碍了Hb活性中心与电极之间的直接电子转移.难以形成有效的电流响应信号.在Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极的CV曲线中可见一对几乎可逆的氧化还原峰，其氧化峰电位（Epa）和还原峰电位（Epc）分别为0.042V和0.127V，峰电位差为85mV，式量电位（E0`）为 0.0845V，这与Nadzhafova[12]等报道的式量电位0.084V相近.Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极具有良好的电化学响应，这是因为微球腔阵列具有较大的比表面积，球腔特殊的“半包含”结构能更好地吸附Hb；高温煅烧后的TiO2薄膜本身就具有较好的亲水性，球腔多孔的存在增加了薄膜的表面能，更增强了其亲水性能，这为保持Hb的活性提供了优良的微环境，对Hb与电极的电子转移具有促进作用.上述因素的综合，使Hb在保持其电化学活性的同时，更容易与电极之间发生电子传递，提高了电极的电流响应.

2.5 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极与扫速的关系

Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极峰电流与扫描速率的关系见图4A，扫描速率由内而外依次为：50mV/s、100mV/s、150mV/s、200mV/s、250mV/s、300mV/s、350mV/s、400mV/s、450mV/s、500mV/s. 随着扫描速度的增加，氧化还原峰电流也随之增加，峰电位略有移动，在50mV/s～500mV/s范围内，峰电流与扫速成正比，其线性方程分别为Ipa（μA）=1.361+0.01286υ（mV/s），R为0.997；Ipc（μA）=-1.583-0.0174υ（mV/s），R为-0.996，表明电极反应为表面控制[13].根据Laviron模型[14]，由Ks=mFnv/RT（m是与峰电位差值有关的常数），求得直接电子转移速率常数为2.97s-1.与文献值[15]血红蛋白在二氧化铈修饰电极上电子转移速率常数0.68s-1，血红蛋白在离子液体[BMIM]PF6碳糊电极上[16]的电子转移速率常数0.149s-1相比，采用本方法固定的Hb具有较大的直接电子转移速率，电化学活性良好.

2.6 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极对H2O2的电催化

图4 不同扫描速率Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极CV图（0.1mol/L PBS，pH7.0）

Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极在0.1mol/L PBS（pH7.0）溶液中对H2O2的电催化见图5.加入H2O2后，氧化峰电流随着加入量的增加明显减小，而还原峰电流逐渐增加，说明Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极对H2O2具有良好的电催化活性，可作为测定H2O2含量的生物传感器.

2.7 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极对工作电位的选择

在不同的工作电位下，修饰于TiO2球腔阵列上的Hb对H2O2的电流响应也不同.图6为不同工作电位下，修饰电极对H2O2的电流响应曲线.在含有0.1mmol/L H2O2的PBS（pH7.0）溶液中，工作电位在0.2V到－0.5V的范围内，随工作电位负移，响应电流增大.考虑到工作电位越负，电活性物质的干扰性越强，而在－0.3V电位下基线电流较小，能有效地减少溶液中电活性物质的干扰，故我们选择工作电位为－0.3V.

2.8 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极的I-T曲线

以Hb/TiO2球阵列/ITO电极为工作电极，在0.1mol/L PBS（pH7.0）溶液中连续加入一定量的H2O2使其浓度依次递增，得到计时电流响应曲线（图7A）.由图可见，加入H2O2后响应电流随即增大，约在6秒内达到平衡，说明该电极对加入的H2O2响应快速.响应电流与其浓度在9.00×10-7～4.44×10-4mol/L内呈线性关系，线性方程为 Ipa（μA）=0.0443+2.558C（mmol/L），R为0.9995（图7B），检出限为 3.12×10-7mol/L（S/N=3）.采用lineweaver-burk方程：

式中，Iss是加入底物后测得的稳态电流，C为底物浓度，Imax是加入饱和底物后测得的最大电流.求得Hb对H2O2催化的米氏常数为0.138mmol/L，该值小于Ma[17]等报道的Hb修饰在聚3羟基丁酸薄膜上的米氏常数1.076mmol/L和罗晓红[18]等报道的Hb修饰在壳聚糖碳纳米管上的米氏常数1.400mmol/L，表明了以本方法固定的Hb对H2O2具有较强的亲和力.

2.9 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极的稳定性和重现性

图5 Hb/TiO2阵列/ITO电极在0.1mol/LPBS（pH7.0）溶液中于不同浓度下H2O2的CV图（扫描速率100mV/s）a：无H2O2；b：0.93mmol/L；c：1.63mmol/L

图6 Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极在不同工作电位下对H2O2的电流响应

图7 （A）Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极在0.1mol/L的PBS（pH7.0）溶液中对连续加入的H2O2的安培响应（工作电位：-0.30V）（B）电流响应与H2O2的关系曲线图

将Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极于0.1mol/L PBS（pH7.0）中，选择扫描速率为100mV/s，连续100圈CV扫描，考察修饰电极的稳定性.结果表明：100圈扫描后的CV图中峰电流、峰电位、峰间距几乎没有变化.Hb/TiO2球腔阵列/ITO电极在浓度为0.5mmol/L H2O2平行测定10次，CV还原峰电流相对标准偏差为4.3%.所制备的传感器在4℃的冰箱中保存7天后测定，响应电流为初始电流的96.3%，放置21天后，响应电流为初始电流的87.0%，实验结果表明Hb修饰TiO2球腔微电极阵列重现性和稳定性良好且具有较长的使用寿命.

3 总 结

本文利用sol-gel法制备了二维有序性良好的TiO2球腔阵列，通过循环伏安法研究表明该阵列具有微电极阵列的特性.利用吸附法将Hb直接固定在TiO2球腔阵列/ITO电极上，研究酶在修饰电极上的电化学活性和对H2O2的电催化活性.实验结果表明：由于TiO2的亲水性环境能很好地保持蛋白质的生物活性，球腔阵列所具有的特殊的网状球腔结构具有更大的比表面积，能有效提高电极表面蛋白质的负载量，并且，TiO2球腔阵列所具有的微电极特性极大改善了蛋白质在电极表面的传质过程，提高了电流信号的信噪比.Hb/TiO2球腔阵列/ITO对H2O2的电催化快速灵敏，具有较低的检出限，催化电流在一定范围内与H2O2浓度呈线性关系，为构建电流型H2O2生物传感器提供了一种方法.

[1]武五爱，郭满栋，尹志芬，等.血红蛋白在纳米孔径氧化铝膜修饰电极上的直接电化学[J].化学学报，2009，67（8）：781-785.

[2]Xian Z Y，Zhou Y Y，Xian Y，et a1.Preparation of poly（vinylpyrrolidone）-protected prussian blue nanoparticles—modified electrode and its eleetrocatalytic reduction for hemoglobin[J].Anal Chim Acta，2005，546（2）:139-146.

[3]侯冬梅，尹凡.血红蛋白在二维纳米金Langmuir-Blodgett单层膜修饰电极上的直接电化学[J].分析测试学报，2009，28（3）:272-276.

[4]Qin Y H，Qin Y C，Guan X H，et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis of heme protrins imobilized on nano-alumina-gold nanopaticles assembly system[J].J Lanzhou University（Natural Sci），2007，43（5）:54-59.

[5]Yeh J I，Lazareck A，Ho K J，et al.Peptide nanowires for coordination and signal transduction of peroxidase biosensors to carbon nanotube electrode arrays[J].Biosens Bioelectron,2007,2（3）:568-574.

[6]古宁宇，董绍俊.超微电极的新进展[J].大学化学，2001，16（1）：26-31.

[7]Xia X H，Wang C，Yang C，et al.Adsorption and direct electron transfer from hemoglobin into a three-dimensionally ordered macroporous gold film[J].Adv Function Mat，2005，15:1267-1275.

[8]程建华，吴以保，曹文丹，等.酸催化溶胶-凝胶法制备纳米TiO2光催化剂的影响因素研究[J].材料导报，2010，24（6）:84-87.

[9]池晓雷，陆婷，汪学英，等.微电极的制备及电化学性质研究[J].常熟理工学院学报，2010，24（2）:52-55.

[10]Davies T J，Sarash W J，Banks C E，et al.The cyclic and linear sweep voltammetry of regular arrays of microdisc electrodes:Fitting of expetimental data[J].J Electroanal Chem，2005，585:51-62.

[11]Dacies T J，Richatd G C.Thecyclic and linear sweep voltameetry of regular and random arrays of microdics electrodes:Theory[J].J Electroanal Chem，2005，585:63-82.

[12]Nadzhafova O Y，Zaitsev V N，Drozdova M V，et al.Heme proteins sequestered in silica sol-gels using surfactants feature direct electron transfer and peroxidase activity[J].Electrochem Commun，2004，6（2）:205-209.

[13]Bard A J，Faulkner L R.Electrochemical methods，fundamental and applications[M].2nd ed.New York:John Wiley Sons，2001:594.

[14]王全林，杨宝军，吕功煊.碳糊电极上无机膜固载血红蛋白的直接电化学[J].高等学校化学学报，2003，24（9）:1561-1566.

[15]李燕，高艳芳，刘俞辰，等.血红蛋白在二氧化铈修饰电极上的直接电化学[J].化学学报，2010，68（12）：1161-1166.

[16]孙伟，高瑞芳，王丹丹，等.血红蛋白在离子液体[BMIM]PF6碳糊电极上的直接电化学[J].物理化学学报，2007，23（8）:1247-1251.

[17]Ma X，Liu X，Xiao H.Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin in poly-3-hydroxy-butyrate membrane[J].Biosens Bioelectron，2005，20（9）:1836-1842.

[18]罗晓虹，妮娜，刘凯，等.血红蛋白在壳聚糖修饰碳纳米管上的电化学特性及对过氧化氢的电催化分析[J].分析测试学报，2009，28（7）：809-813.