基于偏最小二乘法的近红外光谱STR基因分型

陈泽琴 ，汪雪娇 ，谢洪平

（1.苏州大学 医学部药学院，苏州 215123；2.西华师范大学 化学化工学院，四川 南充 637002）

0 引 言

短串联重复序列（STR）是一类广泛分布在人和动物基因组中的DNA重复序列片段，STR的核心序列为2～7bp，呈串联重复排列，重复次数10～60次左右，其总长度一般位于100-400 bp之间，多位于基因编码区附近、基因内含子和非翻译区，并按孟德尔规律呈显性遗传[1,2].人类基因组的STR位点有一半具有多态性，因此，STR作为一类丰富的遗传标记而受到广泛的重视，与过去常用遗传标记相比，具有种类多、分布广、多态信息量大，杂合度高，片段较短，易于聚合酶链反应（PCR）扩增等优点[3]，因而成为现在遗传学研究和医学中最常用的遗传标记[4-9].对于STR基因座的检测，目前常用的有凝胶电泳法、毛细管电泳法、微芯片电泳法和基因测序等方法[10-13]，这些方法可以较为准确地对STR基因型进行检测.但是这些方法通常需要较为复杂的样品前处理或PCR引物标记（如荧光标记、放射线标记）.近红外光谱技术具有无损、简单、快速、低成本等优点，在基因型检测中仅需要一次PCR扩增，且无需分离纯化和荧光标记，可以简化操作过程.但是近红外光谱（NIRS）一般都具有共线性问题，需要利用化学模式识别技术建立化学模式识别模型.本文选择D5S818基因座中总串数差异较大的基因型（即光谱差异较大的基因型）10-10、11-11和13-13进行方法学研究，以NIRS为识别变量，通过判别偏最小二乘（DPLS）化学模式识别方法，建立不同STR基因型的判别模型，实现STR简单、快速、低成本和无需样本预处理的分型检测.

1 实 验

1.1 仪器与试剂

PTC-225型PCR扩增仪（BIO-RAD Inc，USA）；POWER BC6003En型电泳仪（上海申能博彩生物科技有限公司）；GeneGenius凝胶成像系统（SYNGENE Co Ltd，UK）；NICOLET Nexus型傅立叶变换近红外光谱仪（Thermo Electron Co Ltd，USA）；精密数显酸度计（PHS-3TC）；微型混合器（上海沪西仪器厂）；离心机（Tomy，日本）；移液枪（Eppendorf，德国）.

PCR引物（金思特科技（南京）有限公司合成，PAGE级）、Taq DNA 聚合酶（FERMENTAS INC，USA）、琼脂糖（LP0028A，Oxoid Ltd，UK）、溴化锭（Sangon生物公司）、人血液样本（苏州大学司法鉴定所）、其他所用试剂均为分析纯，所有溶液由灭菌去离子水配制.

1.2 基因组DNA的提取

基因组DNA的提取主要是按Chelex100法进行操作[14].取以EDTA抗凝的3名D5S818基因座已知基因型的受试者全血0.2ml至1.5ml的离心管中，加入红细胞裂解液1ml，在10000 rpm下离心5分钟，弃去上清液；加磷酸缓冲液（PBS）1ml，离心，弃去上清液，重复上述过程1次，然后加入0.2ml 5%（m/v）的Chelex100悬浮液悬浮细胞核，56℃保温30分钟；最后在沸水浴中保温8分钟，然后立即置于-20℃冰箱保存备用.

1.3 PCR扩增

实验样本是通过PCR扩增得到的，具体的PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟；然后以95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸7分钟使扩增完全.每一个25μL的PCR反应体系中含有D5S818的两条引物各0.25mmol/L（引物A：5’-GAA TGA TTT TCC TCT TTG GT-3’和引物B：5’-TGA TTC CAA TCA TAG CCA CA-3’），0.2mmol/L的 dNTP，1.5mmol/L的MgCl2，0.625U TaqDNA聚合酶和1×Taq缓冲液，1μL的DNA模板.

1.4 近红外光谱检测

取20μL PCR扩增产物，加水稀释至450μL，置于石英比色皿中；以空气为参比背景，测定PCR产物的近红外光谱.光谱测定的仪器参数为：波数范围9400-4000cm-1，扫描次数32次，分辨率8cm-1，光程10mm和光斑宽2mm.

2 DPLS模型的建立

传统的光谱多元定性方法大都基于主成分分析（PCA），即首先将光谱进行PCA降维并选取特征变量后，再进行聚类或判别分析.近年来，用于光谱多元定量校正的偏最小二乘法（PLS）也被越来越多地用于定性分析中.PLS方法本质上是一种基于特征变量的回归方法，但若将已知类别样本的浓度阵分别设为类指标（0，1）、（1，0）（对两类而言），或（0，0，1）、（0，1，0）、（1，0，0）（对三类而言），多类问题依此类推，则PLS方法可用于有监督的模式识别光谱定性分析，通常称为判别PLS回归（DPLS）[15].本文利用DPLS方法，以近红外光谱为识别变量建立D5S818基因座的10-10、11-11和13-13基因型的分类判别模型，拟实现STR三种基因型的简单、快速、低成本的分型检测. 对于10-10、11-11和13-13基因型的类别变量分别为（1，0，0）、（0，1，0）和（0，0，1）.对于每个基因型的36个样本，随机选择24个为校正样本，其余12个为预测样本.对每个样本的量测光谱预处理，并以交互检验（逐一剔除）方法，得到主成分数10，应用自编Matlab程序建立了三种基因型的DPLS模型：Y=X×β，得回归系数矩阵β.

3 结果与讨论

3.1 光谱预处理

光谱的变化主要由基因型差异、被测样本组成和浓度而产生，为了使光谱的变化仅由基因型的差异所决定，需要消除同一基因型不同样本间的浓度差异.为了消除操作误差，每一基因型样本均使用同一模板进行两次平行的二次PCR扩增，每次扩增18个样本，3个基因型共计得到样本108个.从原始光谱（图1）可见，光谱存在明显的漂移.将原始光谱进行漂移校正，并进行浓度归一化，以消除浓度差异对基因型判别的影响，其结果见图2.同样，另外2个基因型的原始光谱也进行了相同的处理，将处理后的光谱作为建模光谱.

图1 108个样本量测的近红外光谱

图2 漂移校正和浓度归一化后的108个PCR样本的近红外光谱

3.2 基于交互检验的主因子数选择

运用PLS方法建立回归模型在化学测量和有关研究中得到广泛应用，具有稳健、预测精度较高等优点.在DPLS判别分析中，选择的主因子数将直接影响所建立的模型的预测能力，因此运用交互检验（逐一剔除）方法来选择最佳主因子数，保证具有较小的类内距和较大的类间距.由图3可知，当因子数为10时，预测残差平方和PRESS值最小（见图3内插图），即是该模型建立应选用的主因子数.

3.3 STR基因型判别的DPLS模型

图3 交互检验法选择DPLS模型主因子数

基于光谱的模式识别主要有两类方法，一是无监督的聚类分析，常用的方法是将一组待分析样本的光谱进行PCA降维；二是有监督的模式识别，即利用已知样本的类别建立有监督的模式识别模型，DPLS即为此类模式识别方法.与定量校正类似，由于PLS方法同时对光谱阵和类别阵进行分解，加强类别信息在光谱分解时的作用，以提取出与样本类别最相关的光谱信息，即最大化提取不同类别光谱之间的差异，因此PLS方法通常可以得到比PCA方法更优的分类和判别结果.

图4 10-10、11-11与13-13基因型的DPLS判别模型

图5 图4中的10-10基因型放大图

本文以NIRS作为识别变量，对10-10、11-11和13-13基因型分别赋予其类别变量为（1，0，0）、（0，1，0）和（0，0，1），以分类预测率和模型稳健性为基础，通过交互检验，选择最佳主因子数为10，建立STR基因型判别的DPLS模型，其结果参见图4.在图4中可以明显看出，三类基因型能够较好地彼此分离，不存在类间的重叠，且同一类的样本分布较为集中，表明模型能够准确判别基因型，其预测准确率达到100%.从每一类的放大图（参见图5、6和7）可见，每一类的预测集样本基本落于校正集的分布范围内，且不存在明显的过拟合现象，据此表明模型具有良好的稳健性，从而保证了该方法对未知样本基因型判别的重现性.

图6 图4中的11-11基因型放大图

图7 图4中13-13基因型放大图

4 结 论

基于近红外光谱-DPLS方法成功实现了对STR基因型中总串数差异较大的基因型判别，模型的分离性和稳定性均较好，且预测集样本的预测率达到100%.实现了对PCR扩增样本在不经分离提纯等预处理条件下的快速、简单和低成本的紫外光谱基因型判别.

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