牛瑟氏泰勒虫MPSP双表位基因的克隆及原核表达

钱年超，贾立军，薛书江，张 影，张守发

(延边大学农学院/动物医学系，吉林 延吉 133002)

牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)是由泰勒虫科(Theileriidae)、泰勒虫属(Theileria)的瑟氏泰勒虫寄生于红细胞和淋巴细胞内引起的一种血液原虫[1-2]。该病以高热、贫血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状。由于近几年来经贸活动的频繁和养牛业的规模化，该病的流行区逐渐扩大，特别是该病对外地引进牛、纯种牛和改良杂种牛的危害大，已成为严重影响养牛业的疾病之一[3-4]。T.sergenti的抗原成分复杂，其中主要表面蛋白(P33和P32)具有较好的免疫原性，在抗T.sergenti感染中具有重要作用[5]。近年来，国内外学者对此研究较深，但是，一直以来，研制的疫苗未能给动物机体带来稳定、有效的免疫。基于T.sergenti疫苗的研究现状，本实验根据文献[6]证实的表位(E1：DTSKFTPTVA HRLKHAEDLF；E2：APDAFGTGKVYDFVGNFKVT KVKFE)，结合表位分析软件，筛选出主要表面蛋白的2个优势抗原表位并串联成双表位融合基因，进行了原核表达，为构建安全有效的多表位T.sergenti疫苗提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料 牛血液和血清样本采自吉林省延边州某牧场；DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、ExTaq酶、T4连接酶、pMD18-T载体、pGEX-4T-2载体、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ等均购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α和BL21由预防兽医学实验室保存。

1.2 引物的设计与合成 根据T.sergentiMPSP(Major piroplasm surface protein)基因序列(FJ515689.1)，应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计了2对引物，P1、P2为表位E1的引物，P3、P4为表位E2的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为P1：5'-CGGGATCCGCCAATGA GGGATACCGT-3'； P2： 5'-ACCAGAACCTCCACCT CCAGATCCACCTCCACCCCATTCCTTGTCGCTCTT C-3'； P3： 5'-GGATCTGGAGGTGGAGGTTCTGGTG GTGGAGGATCTGGTCTTTTTGCCCCTG-3'； P4：5'-CCGCTCGAGCTTTGACTGCGGTGTATTT-3'。

下划线为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点；方框内为linker(Gly4Ser)3的核苷酸序列。

1.3 目的片段的扩增 以DNA提取试剂盒提取的T.sergenti基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，扩增E1表位基因；以P3和P4为引物，扩增E2表位基因，将2次PCR回收DNA产物作为模板，以Pl和P4为引物，扩增得到双表位基因融合产物。

1.4 目的基因的克隆及鉴定 将纯化的双表位基因融合产物与pMD18-T载体4℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，氨苄青霉素(Amp)筛选阳性克隆，PCR和酶切鉴定并测序。

1.5 原核重组表达质粒的构建及鉴定 用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切阳性克隆质粒和pGEX-4T-2，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，氨苄青霉素(Amp)筛选阳性克隆，PCR和酶切鉴定并测序。

1.6 重组质粒的诱导表达 将阳性转化菌和pGEX-4T-2载体菌接种于LB培养基中，37℃振摇培养过夜，取100 L过夜培养物继续培养至OD600nm值为0.6～1.0，IPTG诱导4 h，收集阳性转化菌和pGEX-4T-2载体菌的沉淀。

1.7 表达产物的SDS-PAGE分析 用100 μL PH7.4的PBS重新悬浮收集的沉淀，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸10 min，取20 μL上清进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白的表达情况。

1.8 表达产物的western blot分析 将凝胶上的蛋白带转移到NC膜上，用10 mL封闭液封闭过夜，分别用T.sergenti血清10 mL(1∶100)和酶标羊抗牛IgG 10 mL(1∶2000)作用2 h，DAB显色，检测表达蛋白的反应原性。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增、克隆及鉴定 以T.sergenti基因组DNA为模板，以P1和P2为引物，扩增E1表位基因长度约为180 bp；以P3和P4为引物，扩增E2表位基因长度约为130 bp。将2次PCR回收的DNA产物作为模板，以Pl和P4为引物，PCR扩增得到双表位基因融合产物，长度约为360 bp(图1)。将360 bp的目的基因克隆到pMD18-T载体，经PCR和酶切鉴定为阳性。

2.2 原核重组表达质粒的构建及鉴定 将双表位融合基因连接pGEX-4T-2，构建pGEX-4T-E1-2重组表达载体。经PCR及酶切鉴定结果，表明pGEX-4TE1-2重组表达载体构建成功(图2)。

2.3 表达产物的SDS-PAGE分析 阳性转化菌经IPTG诱导4 h，SDS-PAGE电泳显示在约39 ku处有一清晰的蛋白条带(图3)，与预期的蛋白分子量大小一致。

2.4 表达产物的western blot分析 表达产物经SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上进行western blot鉴定，出现清晰条带，表明表达产物具有良好的反应原性(图4)。

3 讨 论

T.sergenti寄生于牛的红细胞和淋巴细胞中，研制刺激机体产生细胞免疫的疫苗是预防该病的主要手段。单表位或者多表位疫苗与其他疫苗能诱导机体更强的细胞免疫[7]，所以，选择合适的表位，通过适当的免疫方式，对预防细胞内寄生的T.sergenti尤为重要。

目前，国内外对T.sergenti表位的研究甚少，本实验室结合表位分析软件，确定了两个优势抗原表位，两个表位主要诱导细胞免疫，其中Th1细胞可以产生大量的IFN-γ。因此，本实验选择的两个表位能作为疫苗替代全蛋白疫苗，并发挥表位疫苗的优势。

本实验研究的双表位基因的表达效率高，表达产物可溶性好，而且具有良好的反应原性，这可能是由于选择表位时，除去了全蛋白的疏水区，精确地保留了完整的抗原表位。

本实验通过western blot分析结果表明原核表达的蛋白对T.sergenti阳性血清有反应原性，其免疫保护效果还有待后续的动物试验，将通过筛选表位，选择T细胞和B细胞表位组成的复合表位或者制备疫苗，既可以多种遗传背景的MHC分子识别，扩大免疫范围；又能引起强烈的体液和细胞免疫，综合防治T.sergenti病。

[1]张守发,许应天,梁晚枫.间接荧光抗体试验对牛瑟氏泰勒虫病的诊断[J].中国兽医科技，2003，33(8)：59-61.

[2]Minami T,Fujinaga T,Furuya K,et al.Clinicohematologic and serological comparison of Japanese and Russian strains ofTheileria sergenti[J].Natl Inst Anim Health,1980,20(2):44-52.

[3]张守发，许应天，宋继臣，等.珲春市牛瑟氏泰勒虫精的调查研究[J].延边大学农学学报，1997，19(1)：52-54.

[4]李娟，许应天，张西臣，等.牛瑟氏泰勒虫P33-P23核酸疫苗研究[J].中国兽医学报，2008，28(10)：1171-1173.

[5]许应天，高旭，武振久，等.以p33重组蛋白为抗原建立牛瑟氏泰勒虫病间接ELISA诊断方法[J].中国兽医杂志，2007，43(4)：13-14.

[6]Kakuda T,Chihiro sugimoto,Misao onuma.Epitope-mapping of antigen-specific T lymphocyte in cattle immunized with recombinant major piroplasm surface protein ofTheileria sergenti[J].J Vet Med Sci,2001,63(8):895-901.

[7]史霖，袁育康，胜利，等.多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答的研究[J].细胞与分子免疫学杂志，2006，22(4)：430-432.