基因芯片方法检测6种动物源性人兽共患病病原

王振全，罗宝正，薄清如，徐海聂，沙才华，廖秀云，陈伟生

(1.吉林大学农学部畜牧兽医学院，吉林长春130062；2.珠海出入境检验检疫局国家外来病检测重点实验室，广东珠海519015)

H5亚型禽流感病毒(Avian influenza virus serotype H5， AIV-H5)、狂犬病病毒(Rabies virus，RV)、猪链球菌2型(Streptococcus suis2)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌O157(Escherichia coliO157)6种动物源性人兽共患传染病病原给人们的健康和生活造成了很大的危害。但是目前对于上述病原的检测多以一种或少数几种细菌或病毒为主，很少将人兽共患的细菌和病毒同时检测。在进出境口岸检验过程中对冷冻肉类及蛋类制品往往要求多个项目同时进行，可能同时涉及到检验多种细菌和病毒。在这种情况下，传统的检验方式难以满足快速、精确的检验要求。

基因芯片是具有高通量、集成化、微型化、自动化并且快速、特异性强等特点，目前已广泛应用于病原微生物检测[1-3]、细菌耐药性监测与药物筛选[4]、基因多态性和基因突变分析[5-7]、转基因食品检测[8-9]等领域。本研究根据基因芯片核酸分子杂交的原理，建立一种可同时检验上述6种病原体的快速、灵敏、特异的基因芯片方法，为口岸检测及工商执法提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 病毒株和菌株 H5N1 AIV灭活病毒株购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；RV、甲型H1N1流感病毒、犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均为疫苗毒；S.suis2灭活抗原购自江苏出入境检验检疫局；Salmonella、大肠杆菌E.coliO157、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)、H4N6和H6N2 AIV株由珠海出入境检验检疫局分离保存；炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的阳性模板使用合成DNA的克隆菌。

1.2 主要试剂和仪器 DNA/RNA磁珠提取试剂盒购自深圳易瑞生物技术有限公司；One Step RT-PCR Kit、PCR Amplification Kit、DL Mark 2000 购自宝生物工程(大连)有限公司；生物芯片反应仪系统购自台湾晶宇公司。

1.3 引物和探针设计及合成 根据GenBank中AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157的保守基因序列，利用Clustal X比对，利用Primer Express 2.0设计特异性引物和探针。在上游引物的5'端标记生物素Biotin，在探针的5'端连接Poly(T)，由上海超世生物科技公司合成(表1)。

1.4 6种病原PCR产物的制备 用磁珠法提取6种病原的核酸，利用上述引物，对AIV-H5和RV进行One Step RT-PCR扩增，反应体系为50 μL，反应条件为 50℃ 30 min；94℃ 3 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，35个循环；72℃ 10 min。对S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157扩增时使用PCR Amplification Kit，体系为50 μL，反应条件为 94℃ 3 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃40 s、35个循环；72℃10 min。

1.5 芯片的制备 将合成的探针用探针稀释液调整浓度至40 μmol/L，进行点样，点样矩阵见表2，点样后室温干燥10 min，在紫外交联仪固定(254 nm，1.2 J，7 min～13 min)，Milli-Q水洗涤3次，95%乙醇浸润20 s，50℃干燥10 min。以Poly(T)-Biotin为阳性对照，探针稀释液为空白对照，与本研究中各靶基因没有任何同源性的植物叶绿素的基因为阴性对照。

表1 引物和探针Table 1 Primers and probes

表2 探针点样示意图Table 2 Distribution dots of the microarray

1.6 芯片杂交温度优化试验 取6种病原的PCR产物各 10 μL与 200 μL的 DR.杂交缓冲液充分混合，沸水变性6 min，转移至冰上10 min；将上述混合物转移至芯片室内，平铺均匀，分别在45℃、47℃、49℃、51℃温度下杂交45 min～60 min，选择最佳杂交温度。弃杂交液，用DR.洗涤液洗涤3次；于杂交室中加0.2 μL Strep-AP和 200 μL封闭液的混合液，室温反应30 min，弃封闭液，以DR.洗涤液洗涤3次，吸除芯片上残留的水分；每个芯片室加 4 μL NBT/BCIP 和 196 μL DR.检测液的混合液，置于暗室反应5 min～10 min，弃去检测液，水洗至杂交点清晰为止，用芯片反应仪读取结果。

1.7 芯片杂交特异性试验 分别用6种病原的引物，对参考病毒株和菌株进行PCR扩增，将扩增产物与芯片进行杂交，用于检验各自对应病原的特异性(表 3)。

1.8 芯片杂交灵敏度试验 对提取6种病原核酸定量，分别10倍倍比稀释为7个梯度，利用各梯度核酸作为模板进行PCR，扩增产物分别与芯片杂交，每个梯度重复杂交两次。同时对稀释的各模板梯度做PCR或RT-PCR和荧光PCR，与芯片的灵敏度进行比较。PCR和RT-PCR反应体系及条件同1.4，荧光PCR使用One Step RT-PCR试剂盒，反应条件均为：50℃30 min；94℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃40 s，40个循环。6种病原核酸浓度梯度分别为：AIV-H5：2.86×104pg/μL～2.86×10-2pg/μL；RV：2.25 ×104pg/μL ～2.25 ×10-2pg/μL；S.suis2：1.51×104pg/μL ～1.51 ×10-2pg/μL；B.anthracis：8.9 ×10 pg/μL ～8.9 ×10-5pg/μL；Salmonella：1.38×10 pg/μL～1.38×10-5pg/μL；E.coliO157：1.05×102pg/μL～1.05×10-4pg/μL。

1.9 样品检测 对禽类咽肛拭子589份、猪的鼻腔拭子185份、肉样58份、皮革制品24份以及未注射狂犬疫苗的犬只的唾液样品16份，提取核酸扩增后与基因芯片杂交，分别对6种病原进行检测，将杂交结果与荧光PCR结果比较。

表3 特异性试验分组Table 3 Group of specificity test

2 结果

2.1 6种病原PCR扩增 对AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157进行扩增，得到预期目的片段，表明各病原引物特异性良好。

2.2 杂交温度优化试验 将PCR扩增的6种病原产物与检测芯片分别在45℃、47℃、49℃和51℃温度条件下进行杂交，试验结果显示，在47℃时杂交信号最强，杂交斑点最清晰并且背景信号在可接受范围内，所以确定最佳杂交温度为47℃(图1)。

2.3 杂交特异性试验 分别使用本研究中所检测6种病原的引物，对表3中所列的参考病毒株和菌株进行PCR扩增，将扩增产物分别与芯片杂交检验6种病原的特异性，结果表明，AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella和E.coliO157在芯片对应的位置上出现杂交信号，与每种病原相似的其他参考病原无杂交信号出现，表明芯片的特异性良好(图 2)。

2.4 芯片灵敏度试验 分别采用芯片杂交、常规PCR和Real-time PCR 3种方法比较检测6种病原的灵敏度。基因芯片检测AIV-H5、RV、S.suis2、B.anthracis、Salmonella、E.coliO157的灵敏度分别为 2.86×10-2pg/μL、2.25×10-2pg/μL、1.51×102pg/μL、8.9×10-4pg/μL、1.38×10-5pg/μL、1.05×10-3pg/μL(图3)。检测结果比较表明，基因芯片的灵敏度明显高于常规PCR 10～100倍，略高于荧光PCR(表4)。

2.5 样品检测 利用基因芯片对待测样品进行检验，检测到AIV-H5阳性0份(0/589)；E.coliO1571份(1/58)；S.suis20 份(0/185)；RV 0 份(0/16)；B.anthracis0 份(0/24)；Salmonella2 份(2/58)，结果与荧光PCR检测结果符合为100%。

表4 3种方法检测6种病原的最低浓度Table 4 The minimum detection concentration of three methods

3 讨 论

目前，利用基因芯片技术检测动物传染病所采用的显色标记物主要有荧光标记和非荧光标记两种。本研究中对靶基因的上游引物5'端标记了生物素Biotin，在杂交时只有PCR产物和探针有高度互补序列时出现杂交信号，这样提高了杂交特异性。灵敏度最低可检测到10-5pg/μL，不低于荧光标记方法，略高于荧光定量PCR，高于常规PCR 10倍。但是对S.suis2的灵敏度只能达到100 pg/μL，这可能与S.suis2的基因组较大而含有靶基因拷贝数较少有关系，需作进一步研究。而且，针对同一种方法不同病原之间其灵敏度也有所差别。特异性试验表明6种病原之间互不干扰，无交叉反应，在实验室检验上述6种病原时可以满足实际检验需要。

本研究中根据本地出入境口岸实际需要，制备了可同时检测6种动物源性人兽共患病病原的基因芯片并同时建立了其检测方法。但是本实验尚未达到基因芯片高通量检验，将需要进一步研究。

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