复方米诺地尔酊微生物限度检查方法学的验证

李辽闽 曾庆莉

（1 湖北省襄阳市妇幼保健院，湖北 襄阳 441000；2 湖北省黄石市食品药品监督检验所，湖北 黄石 435000）

复方米诺地尔酊为淡黄色至棕褐色的澄清液体。主要成分为生姜、辣椒、米诺地尔等。对斑秃、脂溢性脱发、病后脱发、老年性脱发均有效。因其具有较强的抑菌作用，采用常规实验方法难以除去其抑菌成分，我们采用薄膜过滤法[1]，按中国药典2005年版二部相关规定[2]进行试验，结果表明，该方法省时、易操作，适用于复方米诺地尔酊微生物限度检查。

1 仪器、试药和菌种

1.1 生物安全柜、隔水式恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（23～28℃）、电热干燥箱（160～250℃）、立式灭菌器、电子天平、薄膜过滤器、集菌仪、超净台。

1.2 营养琼脂、改良马丁氏液体培养基、改良马丁氏琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、营养肉汤、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲胺琼脂培养基，均由北京陆桥技术有限公司生产。

1.3 稀释剂：氯化钠-蛋白胨缓冲液，由北京陆桥技术有限公司生产。

1.4 菌种：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]由中国药品生物制品检定所提供；所有菌种均为第四代。

1.5 样品：复方米诺地尔酊（批号：100305、100510、100916，100ml/瓶）襄阳市妇幼保健院制剂室。

2 方法与结果

2.1 细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法验证试验

2.1.1 菌液的制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养18～24h，各取1mL，分别加9mL的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5～10-7，活菌数约为50～100cfu/mL，做活菌计数备用。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁氏液体培养基中，25℃培养18～24h，取1mL，加9mL的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5～10-7，活菌数约为50～100cfu/mL，做活菌计数备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁氏琼脂斜面培养基中，25℃培养一周，加5mL的0.9%无菌氯化钠溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用标准比浊管比浊。取1mL，加9mL的0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-4，活菌数约为50～100cfu/mL，做活菌计数备用。

2.1.2 供试液的制备

吸取样品10mL至有无菌玻璃珠的250mL三角烧瓶中，加90mL无菌的稀释液，混匀，使成1∶10的供试液。取上述供试液10mL（相当于样品1g），加入100mL无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400的稀释剂冲洗，消除抑菌成分后，取出滤膜，菌面朝上，贴于规定的琼脂平板上培养。

2.1.3 回收率测定

①试验组：分别取1∶10的供试液10mL（相当于样品1g），加入100mL无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400mL的稀释剂冲洗，预留100mL稀释剂各加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1mL（50～100cfu/mL），按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，菌面朝上，贴于规定的琼脂平板上，置规定温度培养24～72h，逐日观察结果。②菌液组：除不加供试液外，其余操作同试验组。③供试品对照组：除不加菌悬液外，其余操作同试验组。④稀释剂对照组：用稀释剂取代供试液，其余操作同试验组。

2.1.4 结果

验证试验至少进行三次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。（所得回收率均不低于70%）。

结论：采用薄膜过滤法检验复方米诺地尔酊，该试验对5种菌种的回收率均高于70%，该验证试验通过。结果见表1。

表1 菌落计数方法验证结果（cfu）

2.2 金黄色葡萄球菌检查方法验证试验

2.2.1 试验组

取1∶10的供试液10mL（相当于样品1g），加入100mL无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400mL的稀释剂冲洗，预留100mL稀释剂，加入金黄色葡萄球1mL（50～100cfu/mL），按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，菌面朝上，贴于甘露醇氯化钠琼脂培养基中35℃培养24h。

2.2.2 阴性菌对照组

取1∶10的供试液10mL（相当于样品1g），加入100mL无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400mL的稀释剂冲洗，预留100mL稀释剂，加大肠埃希菌1mL（50～100cfu/mL），按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，菌面朝上，贴于甘露醇氯化钠琼脂培养基中35℃培养24h。

2.2.3 阳性对照组

除不加供试液外，其余操作同试验组。

2.2.4 阴性对照组

用稀释液取代供试液，不加菌液，其余操作同试验组。

结果：阴性菌对照组未检出阴性对照菌；试验组检出金黄色葡萄球；阳性对照组检出金黄色葡萄球；阴性对照组无菌生长。结论：根据验证试验结果，表明供试品可采用薄膜过滤法检验金黄色葡萄球。

2.3 铜绿假单胞菌检查方法验证试验

2.3.1 试验组

取1∶10的供试液10mL（相当于样品1g），加入100mL无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400mL的稀释剂冲洗，预留100mL稀释剂，加铜绿假单胞菌1ml（50～100cfu/mL），按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，菌面朝上，贴于溴化十六烷三甲胺琼脂培养基中35℃培养24h。

2.3.2 阴性菌对照组

取1∶10的供试液10mL（相当于样品1g），加入100mL无菌稀释液中，混匀，过滤，接着用400mL的稀释剂冲洗，预留100mL稀释剂，加大肠埃希菌1mL（50～100cfu/mL），按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，菌面朝上，贴于溴化十六烷三甲胺琼脂培养基中35℃培养24h。

2.3.3 阳性对照组

除不加供试液外，其余操作同试验组。

2.3.4 阴性对照组

用稀释液取代供试液，不加菌液，其余操作同试验组。

结果：阴性菌对照组未检出阴性对照菌；试验组检出铜绿假单胞菌；阳性对照组检出铜绿假单胞菌；阴性对照组无菌生长。结论：根据验证试验结果，表明供试品可采用薄膜过滤法检验铜绿假单胞菌。

3 讨 论

经过试验观察，说明用薄膜过滤法处理过的供试液适合各种试验菌的生长；供试品对照组无菌生长说明供试品中无影响试验的杂菌；菌液组各种菌生长良好，说明该方法的实验环境适合参加试验的各种菌的生长；阴性对照组无菌生长，说明稀释剂、培养基及试验操作过程符合无菌操作的标准。试验结果表明，采用薄膜过滤法能有效去除复方米诺地尔酊的抑菌成分，对试验菌的生长无影响，该方法适合复方米诺地尔酊的微生物限度检查。

[1] 马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社,2000:60.

[2] 国家药典委员会.中国药典.2005.二部[S].北京:化学工业出版社,2005:附录XI J.