正交试验法优选桑菊饮水煎煮工艺研究

金仲达 朱惠中 赵劲草

（苏州医学院附属常熟第一人民医院，江苏 常熟 215500）

正交试验法优选桑菊饮水煎煮工艺研究

金仲达 朱惠中 赵劲草

（苏州医学院附属常熟第一人民医院，江苏 常熟 215500）

目的优选桑菊饮最佳水煎煮工艺。方法以芦丁、绿原酸、浸出物含量为指标，采用正交试验法，考察浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数、加水量四个因素，对桑菊饮的水煎煮工艺进行优选。结果最佳水煎煮工艺为：浸泡30分钟，加饮片总量8倍量水，煎煮2次，每次30min。结论优选得到的最佳水煎煮工艺稳定、合理。

桑菊饮；芦丁；绿原酸；水煎煮工艺；正交试验

桑菊饮是一剂辛凉解表传统汤剂，出自《温病条辨》卷一，由桑叶、菊花、杏仁、薄荷等八味药组成。具有宣肺止咳、疏风清热的功能，常用于外感风热、咳嗽初起之证，临床疗效确切[1]。中药汤剂是中药的传统剂型之一，汤剂质量的好坏直接影响到临床疗效，汤剂影响疗效的物质基础主要是汤剂中煎出的有效成分，因此要发挥中药汤剂的临床疗效，必须要尽最大限度的煎出有效成分。2010版中国药典中桑叶、菊花的含量测定项下分别以芦丁、绿原酸为指标，用高效液相色谱法测定其含量。在本方中桑叶、菊花为君药，其主要有效成分分别为芦丁、绿原酸。芦丁具有抗炎、抗病毒等作用[2]，绿原酸是菊花发挥药理作用的重要物质基础[3]。因此选择芦丁、绿原酸为指标，采用高效液相色谱法并运用正交试验设计优选最佳的工艺条件。

目前，自煎药机1996年从韩国进入我国，其优于传统煎煮的独特优势已普遍被大家所接受[4,5]。据文献报道，金仁达[6]等按相同加水量，提取时间等对黄芩、金银花、黄柏等进行提取，以药材中的标志性成分作定量指标，结果证明在相同时间内，煎药机煎煮中药成分溶出率明显优于传统砂锅。同时证明，第2次提取仍有60%～80%的溶出量，提示目前临床广泛采用煎药机一次煎药法欠妥。本实验综合了各方面因素，通过煎药机煎煮优选出了桑菊饮最佳水煎煮工艺，为制订一套针对不同煎煮要求复方汤剂的规范化煎煮工艺提供参考，指导临床合理有效用药，满足临床要求。

1 仪器与试药

仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LC-10ADVP型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD-10AVP紫外检测器（日本岛津公司）；电子天平（FA1104）；KQ-500B型超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）；水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；自动双重纯水蒸馏器；YFY20煎药机（北京东华原医疗设备有限责任公司）。

试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、水（重蒸水），其他试剂均为分析纯；对照品：芦丁对照品（批号：100080-200306）、绿原酸对照品（批号：110753-200413）均由中国药品生物制品检定所，供含量测定用。桑叶、菊花、薄荷等饮片均购于安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，并由南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计

采用L9（34）正交表进行正交设计，对浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数、加水量进行考察，设定煎药机温度为110℃，压力0.12MPa。以芦丁、绿原酸和浸出物得率为考察指标，进行提取工艺最佳参数的确定。提取工艺因素水平设计见表1。按处方配比取桑叶、菊花、薄荷等共9份，每份按照正交实验因素水平表操作，过滤后将所得的滤液减压浓缩成稠膏，备用。以判断各因素对提取效果的影响程度，筛选出在该实验条件下最优的提取条件，实验安排及结果见表2，方差分析见表3～5。

表1 水煎煮因素水平表

表2 正交试验结果

表3 芦丁方差分析表

表4 绿原酸方差分析表

表5 水提浸出物方差分析表

2.2 芦丁的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），洗脱程序：0～5min，A为30%；5～10min，A为30%～35%，10～15min，A为35%～40%，15～18min，A为40%～50%；18～20min，A为50%～30%。检测波长：358nm；流速：1mL/min；进样量为10μL；柱温：30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.0639mg的溶液，作为对照品储备溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取约相当于1g桑叶饮片的稠膏，精密称定，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇50mL，加热回流30min，滤过，滤渣再用甲醇50mL，同法提取2次，合并滤液，减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取0.0639mg/mL芦丁对照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL，分别置于1mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，使浓度分别为3.195、6.39、9.585、12.78、15.9755、19.17μg/mL。分别吸取上述各对照品溶液10μL，进样，按上述色谱条件测定峰面积值，以峰面积均值（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y＝16.62X-16.473，r=0.9997（n=6）。结果表明：芦丁进样量在3.195～19.17μg范围内呈良好的线性。

2.2.5 样品中芦丁含量测定

分别精密吸取对照品溶液（浓度分别为：0.003195mg/mL，0.01917mg/mL）以及各供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，每个样品平行进样2次，以外标两点法计算，测定各样品中芦丁的含量。结果见表2、表3。

2.3 绿原酸含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），洗脱程序：0～13min，A为10%～18%；13～30min，A为18%～20%，30～40min，A为20%。检测波长：348nm；流速：1mL/min；进样量为10μL；柱温：30℃。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品适量，置于10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.085mg的溶液，作为对照品储备溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取相当于0.5g菊花饮片的稠膏适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率45kHz）40min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察

精密吸取0.085mg/mL绿原酸对照品溶液0.05、0.1、0.16、0.3、0.4mL，分别置于1mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，使浓度分别为4.25、8.5、13.6、17、25.5μg/mL分别吸取上述各对照品溶液10μL，进样，按上述色谱条件测定峰面积值，以峰面积均值（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y＝14.079X-4.4328，r=0.9995（n=5）。结果表明绿原酸进样量在4.25～25.5μg范围内呈良好的线性。

2.3.5 样品中绿原酸含量测定

分别精密吸取对照品溶液（浓度分别为：4.25 μg/mL，25.5μg/mL）及各供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，每个样品平行进样2次，以外标两点法计算，测定各样品中绿原酸含量。结果见表2、表4。

2.4 浸出物得率测定

精密称取各实验号样品稠膏2g，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，于105 ℃烘箱中干燥3h，取出置干燥器内冷却30min，迅速精密称重，计算浸出物得率。结果见表2、表5。

结果表明，B因素对绿原酸的含量具有极显著性影响，C因素对浸出物的含量具有极显著性影响，其他因素对试验结果未见明显影响。综合芦丁、绿原酸含量及水提浸出物得率的方差分析结果，结合实际应用中病人口服剂量、降低成本、节约时间等因素，最终确定最佳水煎煮工艺为：饮片浸泡30min，加饮片总量8倍量水，煎煮2次，每次30min。

2.6 最佳水煎煮工艺条件的验证

按处方比例取桑叶、菊花、薄荷等各3份，按最佳水煎煮工艺进行水煎煮，即饮片浸泡30min，加饮片总量8倍量水，煎煮2次，每次30min。合并水提液，浓缩至浸膏，取样测定浸膏中芦丁、绿原酸含量及浸出物得率，测定方法和供试品溶液的制备方法与水提正交样品相同。结果见表6。

表6 水煎煮工艺验证试验结果

由表6可见，3次试验所测得的芦丁、绿原酸及浸出物含量与最佳工艺所测得的平均含量相近，说明该工艺稳定、可行。

3 讨 论

3.1 该煎煮方属于解表方，因此在水煎煮过程中，煎煮时间为关键因素。时间过短，苦杏仁等不易煎出，时间过长会导致有效成分尚失，达不到临床疗效。实验结果表明，30min水煎煮的绿原酸的含量最高。

3.2 《中国药典》中桑叶药材含量测定项下流动相为甲醇-水梯度洗脱，但是在规定时间内不出峰，通过预试，将流动相中甲醇和水的比例作了适当调整，最终确定了该实验中的条件，该条件下分离效果较好。

3.3 该实验为在应用煎药机煎煮的基础上，相关参数的设定，如浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数等有了个具有说服力的比较研究。在进一步推广中药煎药机的道路上，未来的研究方向不能仅仅局限于传统煎煮法与煎药机煎煮法的比较，或者局限于单药的煎煮条件研究，而应该针对不同煎煮要求的复方汤剂，在煎药机煎药的工艺条件改进上做进一步的研究，制订一套针对不同煎煮要求复方汤剂的规范化煎煮工艺，以求取得理想的临床疗效。

[1] 蒋玉珍.从桑菊饮、银翘散的组方探讨辛凉解表剂的配伍结构[J].江西中医学院学报,1998,10(2):67.

[2] 蒲秋燕,张艳艳,黄平.桑叶的研究现状[J].科技创新导报,2011(5):7.

[3] 李永霞.湖北产不同品种菊花中绿原酸的含量测定[J].湖北中医杂志,2006,28(2):48-49.

[4] 李毅民,许丽雯,章崇仪,等.机器与传统方法煎药效果的比较[J].中国医院药学杂志,1999,19(11):697.

[5] 梁卫青,郑军献,浦锦宝,等.煎药机煎药与传统方法煎药检出率的比较[J].浙江中医杂志,2005,40(9):404.

[6] 金仁达.中药煎药机对中药有效成分溶出的研究[J]基层中药杂志,1999,13(2):41.

R282.710.2

B

1671-8194（2011）32-0288-03

常熟市科技发展计划项目，正交设计优选不同煎煮要求复方的煎药工艺研究（编号CS200920）