肾舒康合剂对马杉氏肾炎白兔模型血液流变学及肾组织形态的影响

闫翠环 方 敬 陈志强 甄彦君 陈金金 刘云肖 姜秀娟 (河北医科大学,河北 石家庄 05009)

前期研究已经证实,肾舒康能降低尿蛋白、减轻肾组织病理损伤、保护肾功能〔1〕。本研究通过给白兔注射羊抗兔肾血清复制马杉氏肾炎(MGN)动物模型,同时以中药复方肾舒康进行干预性治疗,观察肾舒康对MGN的治疗作用及可能的机制,进一步为临床用药提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级成年绵羊1只,雌性,体重25 kg,由解放军第二军医大学动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(沪)2007-0003);健康新西兰种大耳白兔40只,雄雌兼半,体重1.75～2.25 kg,由武汉市新州区全耀动物养殖场提供,实验动物许可证号:SCXK(鄂)2004-0006。

1.1.2 药物 肾舒康合剂(由黄芪、黄精、白花蛇舌草、地龙、川芎、积雪草、柴胡、丹参、生地、石苇组成,药材购自安国市一方中药材有限公司,由河北省中医院中药房孟熙中药师鉴定为真品)由河北医科大学中医院提供;雷公藤多苷(湖南协力药业有限公司,批号:20050702)。

1.1.3 主要仪器与试剂 HMIAS-2000型医学彩色图像分析系统(武汉千屏影像技术有限责任公司);ZEISS荧光显微镜,HM340E型石蜡切片机(德国ZEISS公司)。280型血流变仪(北京中勤试剂有限公司);722型火焰分光光度计(山东高密彩虹分析仪器厂)。弗氏完全佐剂(Sigma公司,批号:Lot102K8930)。

1.2 方法

1.2.1 白兔MGN模型制备和分组 按传统方法〔2〕制备羊抗兔肾血清,将所有白兔随机分为正常、模型、肾舒康、雷公藤多苷组。除正常组外,其他各组白兔均经耳缘静脉注射羊抗兔肾血清,每次2 ml,间隔0.5 h注射1次,共6次。检测尿蛋白呈阳性反应,表明MGN模型复制成功〔3〕。

1.2.2 给药 复制模型成功后第1天开始灌胃给药,1次/d。肾舒康成人每日用量为黄芪15 g、黄精15 g、生地 15 g、丹参30 g、川芎15 g、石苇 15 g、白花蛇舌草15 g、积雪草 15 g、柴胡10 g、地龙15 g。配伍组方后,砂锅熬制成煎剂。成人生药用量为160 g/d,按动物系数表(B种动物的剂量·mg-1·kg-1=换算系数 ×A种动物的剂量·mg-1·kg-1)折算,白兔的有效生药剂量为8.16 g·kg-1·d-1。各组用药量分别为:肾舒康组8.16 g·kg-1·d-1(生药),雷公藤多苷组5 mg·kg-1·d-1,模型和正常组给予等容量生理盐水,灌胃给药,1次/d,连续4 w。

1.2.3 标本制备与指标检测 ①所有观察对象均于给药4 w后第1天上午8:00～8:30空腹抽取静脉血4 ml,以肝素30 U/ml抗凝,并在 2 h内检测全血黏度 (η b,高切、低切)、血浆黏度(η p)、纤维蛋白原(Fig)、血细胞比容(HCT)。②于用药后4 w末杀检动物,取部分肾组织,4%多聚甲醛溶液固定,酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片,以 3 μ m 的石蜡切片,行Masson染色,光学显微镜下观察并拍片。③取部分肾组织制成冰冻切片,进行间接法免疫荧光检测并拍片。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件,计量数据以±s表示,用单因素方差分析法对实验结果进行统计学分析。

2 结 果

2.1 各组家兔血液流变学指标比较 模型组 η b(200 s-1、5 s-1)、η p、Fig、HCT 与正常组相比均显著升高 (P ＜0.01),提示家兔在造模后出现高凝状态;肾舒康组和雷公藤多苷组与模型组相比,η b(200 s-1、5 s-1)、η p、Fig、HCT 均明显降低(P ＜0.01);两治疗组相比,肾舒康组的各项指标均略低于雷公藤多苷组,但无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 各组白兔光镜观察比较 模型组基底膜重度弥漫性增厚,系膜基质增多,胶原纤维增生,可见局灶节段性肾小球硬化。肾小球囊壁层细胞增生,有大量炎性细胞浸润;间质有炎细胞浸润,可见散在的纤维增生。肾舒康组基底膜增厚较模型组轻,肾小球囊内壁光滑,间质纤维组织增生不明显,仅见少量炎性细胞浸润。雷公藤多苷组动物肾组织形态变化与肾舒康组基本相似,但胶原纤维增生程度较肾舒康组略重。见图1。

2.3 各组白兔免疫荧光比较 模型组可见免疫球蛋白G(IgG)沿基底膜和系膜线状排列,荧光强度较强。肾舒康组和雷公藤多苷组偶见IgG沿基底膜线状排列,荧光强度明显减弱,各组均未见补体C3。见图2。

表1 各组家兔血液流变学比较(±s,n=10)

表1 各组家兔血液流变学比较(±s,n=10)

与正常组比较:1)P＜0.05,2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.01

组别 n η b(200 s-1 mPa·s) η b(5 s-1mPa·s) η p(mPa·s) Fig(g/L) HCT(%)正常组 10 3.51±0.29 7.72±0.30 1.35 ±0.065 1.27±0.14 0.40 ±0.04模型组 8 5.23±0.58 2) 11.38 ±1.092) 2.02±0.26 2) 2.10 ±0.322) 0.60±0.082)肾舒康组 10 4.43±0.46 2)3) 10.22 ±0.692)3) 1.52±0.11 1) 1.53±0.201)3) 0.50 ±0.052)3)雷公藤多苷组 10 4.52±0.51 2)3) 10.37±0.682)3) 1.60±0.122)3) 1.59±0.182)3) 0.52±0.062)3)

图1 各组病理切片(Masson,×400)

图2 各组免疫荧光图片(荧光,×400)

3 讨 论

MGN是一种典型的抗肾小球基底膜性肾小球肾炎,其病理变化为渗出及增殖性改变,与人类此种肾炎病理改变相近,是较理想的肾炎模型;其主要临床表现为肾病综合征(NS),随着疾病的发展甚至会引起肾功能的严重损伤〔4〕。对于NS,目前临床多采用激素类、免疫抑制剂等药物进行治疗,但随着患者年龄增大、人体免疫组织功能减退、激素水平下降,导致机体对激素的敏感性降低;中老年组病人中血管硬化逐渐加重,肾动脉硬化导致肾功能恶化,降低对激素的疗效;中老年病人中较多合并或伴有其他全身性疾病,如高血压、糖尿病,限制了激素临床应用,降低了激素的疗效。所以其疗效除与病理分型有关外,尚与患者年龄大小有关〔5〕,故不受年龄限制、低毒副作用的药物成为研究的重点。

肾舒康是按NS脾肾功能失调、阴阳气血不足,水湿、湿热、瘀血阻滞的病机特点拟定的,本方由黄芪、黄精、生地、丹参、川芎、石苇、白花蛇舌草、积雪草、柴胡、地龙10味中药组成,共奏健脾补肾、活血化瘀、清热利湿之功效。

方中黄芪、黄精、生地为君药,共奏健脾补肾、益气养阴之功效,三药合用,健脾温中而不燥,益肾养阴而不腻,并助诸药之力,使气旺以促血行,祛瘀而不伤正;丹参、川芎、地龙、柴胡为臣药,具有活血化瘀通络、调畅气血运行的功效,本方中柴胡配川芎可以气血同治,相互协同以畅行气血;积雪草、白花蛇舌草、石苇为佐使药,三味药配伍,共同发挥清热利湿、解毒消肿的作用。

肾损伤及肾小球肾炎患者不论是否合并肾衰竭,均存在血液流变学改变。NS的高凝状态主要因大量蛋白从尿中排出及代偿性肝脏合成蛋白增加,引起凝血、抗凝、纤溶系统成分改变及血小板功能紊乱所致。激素和利尿剂的长期大量使用等原因也可导致明显的血液高凝状态〔6〕,故活血化瘀在NS治疗中存在一定的重要性和必要性〔7〕。现代药理研究证实黄芪可降低血小板的聚集性,增强红细胞的变形能力,缓解高凝状态,并能改变血瘀时的血流状态,疏通微循环,保护肾功能〔8〕。丹参用于肾病治疗主要功能体现在改善肾脏微循环〔9〕方面,丹参活血化瘀能改善微循环障碍,增加肾组织血流量,调节血液流变性,抑制血小板的聚集,降低血液黏稠度。川芎所含主要有效成分为川芎嗪和阿魏酸等,具有清除氧自由基、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用,可扩张肾小血管,降低肾内压,改善肾血流灌注。地龙有抗凝、抗血栓作用,能降低血液的黏度,抑制血栓形成,还具有促纤溶作用,能使已形成的血栓溶解。地龙水煎液可降低血中HCT值,延长凝血时间,增加微血管口径及开放数,改善微循环。白花蛇舌草有清热除湿、活血止痛等功效,其含有的总黄酮具有增强机体特异性免疫功能和非特异性免疫功能的作用,亦可以刺激网状内皮系统增生,增强吞噬细胞活力而达到抗菌消炎作用〔10〕。与黄芪、黄精、生地、石苇配伍还可增加机体非特异性免疫力,促进机体诱生干扰素的能力,减少免疫复合物(IC)的沉积,减轻免疫性因素对血管内皮的损伤而发挥对肾组织的保护作用。

实验结果显示,肾舒康合剂能明显改善肾血流动力学异常,缓解高凝状态带来的肾脏损害,并能减少IC在GBM的沉积,减轻由于IC沉积所造成的一系列病变,延缓肾组织的病变进程,对MGN家兔起到了明显的治疗作用。其机制可能为以下几点:①改善血液流变学,降低血液黏度、血浆黏度和HCT水平,同时可预防血栓的形成;②改善血流动力学,增加动脉血流量,降低血管阻力;③改善微循环,解除微血管痉挛,增加微血管血流,降低毛细血管通透性,减少毛细血管渗血,促进肾小球修复和再生。

1 韩 琳,张边江,陈志强 .肾舒康对家兔 C-BSA肾炎模型治疗作用的研究〔J〕.河北中医药学报,2006;12(3):5-7,26.

2 闫翠环,方 敬,王艳素,等.肾舒康合剂对马杉氏肾炎白兔肾功能的影响〔J〕.中国药房,2011;22(15):1351-3.

3 桂常青,洪宗元,杨介人,等.家兔Masugi肾炎模型的制备及应用茶多酚治疗的疗效观察〔J〕.中国药理学通报,1998;14(5):467-9.

4 王海燕.肾脏病学〔M〕.北京:人民卫生出版社,1996:531-2.

5 施莲珍,姚能才 .激素治疗肾病综合征的疗效与年龄的关系〔J〕.河北医学,1998;4(2):85.

6 王海燕.肾脏病学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2008:947.

7 叶任高.中西医结合肾脏病学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2003:208-48.

8 徐巨海,周 蓉,杜丽丽,等 .黄芪注射液对肾病综合征患者血小板活化功能的影响〔J〕.中国中西医结合肾病杂志,2002;3(4):225-30.

9 吕 勇,王亿平,李文娟,等 .慢性肾衰竭血瘀证患者血清NO、ET、IL-6的水平变化及雷氏丹参片干预作用的临床研究〔J〕.中成药,2006;28(1):63-7.

10 陈 雅,杨坤星 .白花蛇舌草的化学成分及临床应用〔J〕.中国药业,2008;17(5):62-3.