慢性间歇低氧对大鼠肾脏组织细胞形态和超微结构的影响

邵 川 鲁沈源 励雯静 隆 玄 李善群 白春学 (复旦大学附属中山医院呼吸科,上海 200032)

肾脏是一个高血流量高灌注的脏器,对氧供给和氧张力的变化较敏感,因此很容易受到缺氧性损伤〔1〕,成为阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)容易累及的靶器官之一。目前对OSAHS引起肾脏损害的具体机制尚未完全阐明,相关基础研究匮乏。慢性间歇低氧(CIH)是OSAHS的重要病理生理过程之一,是引起全身和局部氧化应激、炎症反应的重要环节。本研究通过观察CIH大鼠肾脏组织细胞形态和超微结构的变化初步探讨OSAHS对肾脏的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物舱、气体控制通路装置、氧浓度测量仪(灵敏度0.1%)由上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂特约制作。医用压缩氧气 (浓度 ＞99.5%)、压缩氮气 (高纯氮,浓度 ＞99.999%)、压缩空气由上海五钢气体有限责任公司充装。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 清洁级雄性SD大鼠18只,体重140～150 g,鼠龄4周龄,随机分对照组和CIH组,每组8只。

1.2.2 CIH动物模型的建立 将CIH组置于低氧动物舱,在氧浓度测量仪的监测下,通过控制程序调节氧气、氮气的输入流量从而调控箱内氧浓度,氧气、氮气的输入时间和顺序如下:输入纯氮气 30 s(FiO2降至7%左右)-静息10 s-输入纯氧气20 s(FiO2升至21%左右),每分钟为一个缺氧循环,低氧动物舱内的氧气浓度呈周期性波动。舱内CO2与水蒸气用适量钠石灰吸收。每天8 h,持续35 d。对照组舱内输入空气,其余条件同CIH组。

1.2.3 标本采集 16.7%乌来糖(氨基甲酸乙酯)溶液0.15 ml/10 g体重腹腔注射麻醉,迅速切下左肾小块肾皮质,在预冷的电镜固定液中将其切成3～4块1 mm×1 mm×1 mm的小块置入电镜固定液4℃保存。生理盐水150 ml(室温)、4%多聚甲醛(4℃)500 ml灌流固定后取右肾放入中性甲醛4℃保存。

1.2.4 HE染色 组织块常规石蜡包埋,4 μ m切片,切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗。苏木素染色5 min,自来水冲洗。盐酸乙醇分化30 s(提插数下)。自来水浸泡15 min。置伊红液2 min。常规脱水,透明,封片。普通光镜下观察。

1.2.5 透射电镜检查 标本按常规方法处理后,做成80 nm超薄切片,用醋酸铀-柠檬酸铅双染色法染色,在Pilipps CM120透射电镜下观察肾近曲小管上皮细胞超微结构。病变按严重程度分为4级:无病变(-)、轻度病变(+)、中度病变()、中度病变()。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0软件包进行确切概率统计法。

2 结 果

2.1 组织细胞形态 对照组肾小球、近曲小管和远曲小管未见明显异常。CIH组8例均表现为肾小球高度肿胀,肾球囊狭窄,球囊间隙消失(P=0.000);肾小管上皮细胞高度肿胀变性,管腔狭窄以至消失(P=0.000),远曲小管未见明显异常,如图1。

图1 两组大鼠肾脏HE染色组织病理图(×400)

图2 两组大鼠肾近曲小管上皮细胞透射电镜图(×8 400)

2.2 超微结构 对照组肾近曲小管上皮细胞超微结构无异常表现。CIH组近曲小管上皮细胞超微结构均出现不同程度的空泡变性、核膜肿胀和线粒体肿胀,其中空泡变性均为重度(P=0.000);核膜肿胀7例为中度,2例为重度(P=0.001);线粒体肿胀7例为轻度,2例为中度(P=0.000)。如表1、图2。

表1 两组大鼠肾近曲小管上皮细胞超微结构(n,n=8)

3 讨 论

OSAHS以反复上气道阻塞从而导致间歇性呼吸暂停和低通气为特点。临床表现包括打鼾、睡眠结构紊乱、注意力和记忆力下降、情绪低落和日间嗜睡等〔2〕。近些年的研究发现 OSAHS亦可引起血肌酐升高和尿蛋白增加〔3～5〕,此外 OSAHS也可能对肾脏的内分泌功能产生影响。OSAHS对肾脏影响的具体机制尚未阐明,CIH是OSAHS的重要病理生理过程之一,是导致OSAHS患者体内氧化应激失衡和炎症反应的重要环节,推测CIH可能是OSAHS患者肾脏损害的原因之一,因此我们通过CIH动物模型,初步探讨CIH对肾脏的影响,借此进一步理解OSAHS肾脏损害的致病机制。

我们的研究发现肾脏组织形态在CIH的影响下已出现显著的可逆性损伤,肾小球肿胀和肾球囊狭窄可能对肾小球滤过功能产生影响,肾小管上皮细胞肿胀和管腔狭窄也可能影响到肾小管的重吸收和分泌功能。我们推测随着CIH时间的延长,肾脏形态学损伤将进一步加重甚至出现组织细胞凋亡、坏死、间质增生、纤维化等反应。透射电镜检查发现CIH大鼠肾近曲小管上皮细胞出现大量空泡变性、核膜肿胀和线粒体肿胀。空泡是扩张的内质网,内质网肿胀到一定程度可变成囊泡状,即镜下观察到的空泡变性。内质网是细胞质中由相互连通的管道、扁平囊和潴泡所组成的膜系统,主要功能是参加蛋白质和脂质的合成、加工、包装和运输,内质网肿胀和功能障碍将影响蛋白质和脂质的合成和分泌,从而广泛影响细胞功能。核膜是位于真核生物的核与细胞质交界处的双层结构膜,它作为细胞质同细胞核之间的界膜,对稳定核的形态和化学成分起着十分重要的作用。核膜的主要功能包括屏障作用、控制细胞核与细胞质之间的信息和物质交换、协助染色质(体)定位和细胞分裂以及某些生物合成的功能等。核膜肿胀将对核膜的多种功能产生影响甚至关系到细胞存亡。线粒体是具有双层膜结构的细胞器,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴,两层膜之间有腔。线粒体主要功能是将有机物氧化产生的能量转化为ATP,是细胞内能量产生的主要场所。线粒体在细胞缺氧中毒时可变空,嵴减少或消失,体积增大,甚至破裂,即线粒体肿胀。线粒体肿胀将直接导致细胞能量代谢障碍,这可能是CIH大鼠肾近曲小管上皮细胞高度水肿的原因之一。

总之,我们的研究发现CIH对肾脏超微结构、组织形态有显著影响。本研究的不足之处是未同时设立持续低氧组和复氧干预组。持续低氧与CIH所引起的病理生理过程不同,通过比较可进一步探讨CIH导致肾脏损害的特点,设立复氧干预组不但可以再次验证实验结果,还能探讨CIH肾损伤的防治机制,为持续气道正压(CPAP)治疗OSAHS相关的肾损伤提供理论依据,这些有待于我们今后进一步研究。

1 Nangaku M,Eckardt KU.Hypoxia and the HIF system in kidney disease〔J〕.J Mol Med,2007;85(12):1325-30.

2 Lieberman JA 3rd.Obstructive sleep apnea(OSA)and excessive sleepiness associated with OSA:recognition in the primary care setting 〔J〕.Postgrad Med,2009;121(4):33-41.

3 Büchner NJ,Henning BF,Hägele KF,et al.Renal function in hypertensive patients with obstructive sleep apnea〔J〕.Dtsch Med Wochenschr,2004;129(7):305-9.

4 Michael DF,Amy Storfer Isser,H Lester Kirchner,et al.Obstructive sleep apnea is associated with increased urinary albumin excretion 〔J〕.Sleep,2007;30(7):923-9.

5 Ahmet Ursavas,Mehmet Karadag,Mustafa Gullulu,et al.Low-grade urinary albumin excretion in normotensive/non-diabetic obstructive sleep apnea patients〔J〕.Sleep Breath,2008;12(2):217-22.