神经调节蛋白-1对糖尿病心肌病大鼠心肌重构的影响

黄 鑫，李宾公，郑泽琪，肖 坚，李 勇，李 哲

(南昌大学第一附属医院心内科，江西省高血压病研究所，江西南昌 330006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一类以心力衰竭为主要临床表现，与冠状动脉粥样硬化无关的特异性、弥漫性糖尿病相关性心肌病［1］。其主要病理改变为细胞外基质重塑，涉及心肌细胞凋亡、坏死及心肌纤维化等病理生理改变过程。DCM发病机制尚未完全阐明，目前研究认为和心肌细胞代谢障碍、心肌微血管病变、心脏自神经病变、细胞因子异常等因素有关［2－3］。除了控制血糖等综合治疗外，尚无特异性的有效治疗措施。

神经调节蛋白-1(neuregulin-1，NRG-1)是一种调节和保护性生长因子，因其首先在神经科学领域发现而得名。近年来研究表明，NRG-1具有促进心肌细胞增殖、抑制心肌细胞凋亡、促进血管新生等心脏保护作用。应用重组NRG-1治疗心肌梗死后心力衰竭的基础与临床实验也取得了一定进展［4－5］。基于以上研究现状，本实验采用链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导制作DCM大鼠模型，经静脉途径注射人重组NGR-1，观察NRG-1对DCM的治疗作用，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 STZ购自Sigma公司;重组NRG-1购自上海希美生物科技有限公司;赫赛汀(Herceptin)购自武汉日升科技发展有限公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自Promega公司;TRIzol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 DCM模型制作 ♂ SD大鼠40只(体质量200～220 g)，随机选取8只为正常普通饲料饲养(Control组)，其余32只大鼠为模型组，参考相关文献后采用一次性腹腔注射STZ(50 μg·g－1)诱导I型糖尿病模型［6］，1周后检测血糖，血糖≥16.7 mmol·L－1者认为糖尿病模型建成，血糖稳定12周后DCM模型建成。

1.2.2 实验分组和干预 32只大鼠经STZ诱导12周后，排除血糖未达标准(诱导不成功)及中途死亡大鼠外，剩余24只，随机再分为3组，其中NRG-1组(n=8)大鼠尾静脉注射重组NRG-1(0.01 μg·g－1，隔日1次，共 2周);HERCE 组(n=8)大鼠除相同方法注射 NRG-1外，每周2次尾静脉注射ErbB2 受体拮抗剂赫赛汀(Herceptin，0.01 μg·g－1，共2周);DCM组(n=8)大鼠以同样方法尾静脉注射PBS(1 μl·g－1)共2周。以上各组大鼠在同等条件下继续饲养2周后进行以下实验。

1.3 观察指标

1.3.1 心脏超声评价心功能 各组大鼠于DCM诱导16周末，用水合氯醛(0.2 g·100 g－1体重)腹腔注射麻醉，仰卧固定，使用 Hewlett Packard Sonos 5500心脏超声诊断仪，探头12 S，频率12 MHz，在取得满意的胸骨旁左心室短轴二维超声图像后，通过M型超声获得舒张末及收缩末左心室内径，计算左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(FS)以评价心脏收缩功能。于心尖四腔心切面，在TDI模式下，获取二尖瓣环运动频谱，测量舒张早期运动速度(Em)、舒张晚期运动速度(Am)，计算Em/Am比值评价心脏舒张功能。心功能检测完毕后，取出大鼠心脏进行如下实验。

1.3.2 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 心肌组织固定，制作蜡块切片，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡心肌细胞。

按照Tunel试剂盒说明书逐步添加试剂，光学显微镜下观察、拍照。每张切片均在400倍镜下随机取5个视野，计算凋亡指数(AI，每100个细胞核中所含凋亡细胞数)，求其均值。

1.3.3 Masson胶原特殊染色及胶原容积分数(CVF)的测定 常规石蜡切片脱蜡，采用Masson染色，逐级乙醇脱水，中性树脂包埋，镜下观察并摄片。采用图像分析系统，测量心肌组织胶原容积分数(CVF)，CVF=胶原面积/总面积，每张切片均随机取3个视野测量，计算其均值。

1.3.4 实时定量RT-PCR 取100 mg心肌组织采用TRIzol一步法提取RNA。取1.5 g总RNA逆转录成cDNA。采用荧光染料法，按照试剂盒说明操作进行，以 β-肌动蛋白(β-actin)为内参。引物设计:Bcl-2上游5'-CGGGAGATCGTGATGAAGT-3'，下游5'-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3'(422 bp);bax 上游 5'-GCAGGGAGGATGGCTGGGGAGA-3'，下游5'-TCCAGACAAGCAGCCGCTCACG-3'(579 bp);Ⅰ型胶原，上游 5'-GTTCGTGGTTCTCAGGGTAG-3'，下游 5'-TTGTCGTAGCAGGGTTCTTT-3'(654 bp);Ⅲ型胶原，上游5'-TGCCCACAGCCTTCTACACCCT-3'，下游 5'-CAGCCATTCCTCCCACTCCAG-3'(254 bp);β-actin上游5'-TGTGCTATGTTGCCCTAGACTTC -3'，下 游 5'-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3'(450 bp)。以上引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2 结果

2.1 血糖测定 各组大鼠实验终点(诱导16周后)时进行血糖监测，DCM组为(21.5±3.2)mmol·L－1，NRG-1 组为(19.7 ± 2.1)mmol·L－1，HERCE 组为(20.3± 2.5)mmol·L－1，以上各组间差异无显著性(P＞0.05)，较 Control组(5.8±1.23)mmol·L－1明显增高(P ＜0.05)。

2.2 大鼠心功能变化 经腹腔注射STZ 16周后，与Control组相比，DCM组大鼠心脏收缩、舒张功能均降低，表现为LVEF、FS、Em/Am下降(P＜0.05)，说明糖尿病心肌病造模成功。与DCM组相比，NRG-1组 LVEF、FS、Em/Am均明显升高(P＜0.05)，提示应用NRG-1后，心功能得到好转。而HERCE组与 DCM 组相比，LVEF、FS、Em/Am 变化无差异(P＞0.05)，说明通过干扰ErbB信号通路后，NRG-1对大鼠不再有心脏保护作用。

Tab 1 The comparison of rat heart function assessed by echocardiogram(±s，n=8)

Tab 1 The comparison of rat heart function assessed by echocardiogram(±s，n=8)

*P≤ 0.05 vs control;#P＜0.05 vs DCM;△P＜0.05 vs NRG-1

Control DCM NRG-1 HERCE LVEF/% 85.1 ±5.8 74.4 ±4.2* 79.9 ±5.1# 71.8 ±4.6＊△FS/% 55.4 ±3.9 45.5 ±3.6* 50.7 ±4.3*# 43.6 ±2.8＊△Em/Am 1.31 ±0.21 0.82 ±0.17* 1.08 ±0.19*#0.85 ±0.23＊△

2.3 心肌细胞凋亡及相关基因表达的变化TUNEL法染色检测心肌细胞凋亡情况见Fig 1。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色(箭头所指)。与Control组相比，DCM组大鼠心肌细胞AI明显上升(P＜0.05)，说明糖尿病心肌中有大量心肌细胞凋亡。与DCM组相比，NRG-1组AI明显下降(P＜0.05)，提示应用NRG-1后，可以抑制心肌细胞凋亡。而HERCE组与DCM组相比，AI变化无差异(P＞0.05)，说明通过干扰ErbB信号通路后，NRG-1抑制心肌细胞凋亡的作用消失。实时定量RT-PCR检测凋亡相关基因，结果表明，与Control组相比，DCM组大鼠心肌中bcl-2基因表达下降而bax基因表达上调(P＜0.05)，应用NRG-1后可逆转这种变化，而HERCE组bcl-2、bax基因表达与DCM组相比，变化无差异(P＞0.05)。

Fig 1 (A).Cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL method(×400)C:Control，D:DCM，N:NRG-1，H:HERCE;(B).Analysis of cardiomyocyte apoptosis.*P≤0.05 vs control;#P＜0.05 vs DCM;△P＜0.05 vs NRG-1;(C).Statistical analysis of the expression of apoptosis related mRNA detected by PCR.*P≤0.05 vs control;#P＜0.05 vs DCM;△P＜0.05 vs NRG-1

Fig 2 (A)Fibrotic infiltration in the myocardium with Masson's trichrome staining(×200);(B)Quantitative analysis of fibrosis.*P≤0.05 vs control;#P＜0.05 vs DCM;△P＜0.05 vs NRG-1;(C)Statistical analysis of the expression of fibrosis related mRNA detected by PCR.*P≤0.05 vs control;#P＜0.05 vs DCM;△P＜0.05 vs NRG-1

2.4 心肌组织胶原含量及相关基因表达变化 光镜下胶原纤维呈蓝色，心肌细胞质呈红色，胞核黑蓝色。正常大鼠心肌血管周围、细胞之间有少量的胶原纤维存在，形似蜂窝。各实验组心肌胶原纤维含量较正常组都有不同程度的增加，且分布比较弥散，排列紊乱。与 Control组相比，DCM组大鼠心肌CVF明显上升(P＜0.05)。与DCM组相比，NRG-1组CVF明显下降(P＜0.05)，而HERCE组与DCM组相比，CVF变化无差异(P＞0.05)。实时定量RT-PCR检测胶原相关基因表达，结果表明，与Control组相比，DCM组大鼠心肌中I、Ⅲ型胶原mRNA表达上调(P＜0.05)，应用NRG-1后可逆转这种变化，而HERCE组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达与DCM组相比，变化无差异(P＞0.05)。

3 讨论

本实验中我们成功制作DCM动物模型，并首次尝试应用NRG-1治疗DCM。初步研究结果表明，NGR-1能抑制心肌细胞凋亡，抑制心肌纤维化，从而改善心功能。

研究表明，NRG-1在成年心脏心内膜和心肌微血管内皮细胞中有较高表达，而在主动脉、冠状动脉、冠状静脉内皮细胞中则不表达［7］。NRG-1可作为上皮生长因子酪氨酸激酶受体家族(ErbB1-4)的激动剂或配体，其基因及蛋白产物目前被众多学者关注［8］。在正常心肌中，只有 ErbB 2、ErbB 4可与NRG-1结合，NRG-1与心肌细胞膜上的 ErbB2/ErbB4受体复合物结合后，引发胞内信号分子，导致存在于细胞内具有转录激活功能的蛋白质被磷酸化而活化，活化后的转录因子进入细胞核，与特定的靶基因结合，诱导晚期基因表达从而产生各种生理功能。NRG-1 可通过 MEK/ERK、PI3K/Akt、Src/FAK、NO合酶等多种信号通路发挥作用，参与细胞分化、增殖与凋亡调节［9－11］。本实验证实应用NRG-1后心肌细胞凋亡减轻，其作用推测是通过上调Bcl-2、下降Bax而产生的。Bcl-2与Bax是公认的与凋亡密切相关的调控蛋白，Bcl-2位于线粒体膜，主要功能是促进细胞生存，抑制细胞凋亡;Bax位于胞质中，当Bax高表达时，可从胞质转位至线粒体膜，与Bcl-2结合形成异二聚体，使之灭活，减少具有活性的Bcl-2分子数，改变线粒体膜的通透性，引起线粒体损伤，促进细胞凋亡［12］。NRG-1对Bcl-2/Bax比值的影响，推测和激活Akt等信号途径有关。

心肌纤维化是DCM特征性病理表现，最终将导致心室舒缩功能不全［13］。在糖尿病心肌病合并心力衰竭或长期高血糖的刺激下，心肌细胞NRG-1/ErbB信号系统是受损的，此时心脏迷走神经被抑制、交感神经相对较兴奋，于是心衰的危险性增加［14］，RAAS系统被激活，直接反应为血管紧张素Ⅱ、TGF-β1表达上调，从而促进心肌纤维化的进行。除了影响心脏自主神经外，NRG-1激活ErbB受体后，可提高心脏内皮NO合酶的活性，而NO合酶活性升高，可降低交感神经的活性，抑制RAAS系统激活，减少血管紧张素Ⅱ的表达，减少成纤维细胞的增生以及胶原的合成，从而减少心肌纤维化的程度［15－16］。

总之，本研究提示在DCM合并心力衰竭的发生机制中，NRG-1/ErbB信号系统完整性起着重要的作用，外源性补给NRG-1可激活NRG-1/ErbB信号通路，并进一步抑制心肌细胞的凋亡、减少心肌纤维化的程度，从而抑制心室重构，保护心脏功能，这为DCM治疗提供了新的思路，当然其在DCM治疗中的作用，尚需进一步临床研究证实。

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