参芪二仙片质量标准研究

赵玉华 ，崔晓娟 ，樊 萍 ，王卫锋 ，李 芳 ，石敏娟

1.陕西中医学院药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003

参芪二仙片为中华人民共和国卫生部 《中药成方制剂》第20册中所收载，是由红参、黄芪、当归等八味中药组成的中药复方制剂，具有补肾填精、调补冲任、益气养血的功效，用于肾虚腰膝酸软、阳痿早泄、遗精、妇女更年期经血不调等症。原质量标准中，仅有一项显微鉴别，为了更好地控制该制剂的质量，参照有关文献[1-5]，笔者对方中的主要药味，进行了专属性较强的薄层鉴别研究，并对方中的主要药物淫羊藿中的淫羊藿苷进行了含量测定的方法学研究，结果此方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。现将结果报道如下：

1 仪器与试药

高效液相色谱仪 （美国SSI）、超声波清洗机 （KH-300DE）、BP211D型分析天平 （德国赛多利斯）、TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）；人参皂苷Rg1对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110703-200726，供含量测定用）、人参皂苷Rb1对照品 （中国药品生物制品检定所，批号：110704-200420，供含量测定用）、当归对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120927-200613，供鉴别用）、盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100713-200609，供含量测定用）、淫羊藿苷对照品 （中国药品生物制品检定所，批号：110737-200415，供含量测定用）。参芪二仙片自制（批号：080501、080502、080503）； 乙腈为色谱纯， 水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 TLC法鉴别红参 取本品25片，除去包衣，研细，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取3 h，三氯甲烷液备用；药渣继续用甲醇回流提取至近无色，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水20 ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20 ml，弃去，再用水洗2次，每次20 ml，弃去，正丁醇液水浴蒸干，残渣加水5 ml使溶解，然后上处理好的D101大孔吸附树脂柱（直径 1.5 cm，高12 cm），先用水150 ml洗脱，弃去，再用50%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1和Rb1对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置过夜后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热约10 min使斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。

2.1.2 TLC法鉴别当归 取“2.1.1”项下的三氯甲烷提取液，水浴蒸至约5 ml作为供试品溶液。另取当归对照药材1 g，加乙醚20 ml回流提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解作为对照药材溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。

2.1.3 TLC法鉴别黄柏 取本品3片，除去包衣，研细，加甲醇20 ml回流提取15 min，滤过，滤液浓缩至5 ml，作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液作为对照品溶液；再取黄柏对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取对照品溶液及对照药材溶液各2 μl，供试品溶液5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨（6.0∶3.0∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，用氨蒸气饱和后展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。

2.2 淫羊藿苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Phenomenex ODS柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（28∶72）；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；进样量：5 μl。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.010 mg的淫羊藿苷对照品溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品20片，精密称定，除去包衣，研细，取约0.5 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加稀乙醇约45 ml，超声处理30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺淫羊藿的阴性对照样品，同供试品溶液的制备方法，制备成阴性对照溶液。

2.2.5 干扰试验 照“2.2.1”项下色谱条件，吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 μl，分别依次进样。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有色谱峰出现，而阴性对照液在淫羊藿苷色谱峰位置处无相应峰出现，表明阴性无干扰。见图1。

2.2.6 线性关系考察 取对照品溶液 （0.011 mg/ml）2、4、6、8、10、12 μl进样，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得标准曲线方程 Y=2677350X-436，相关系数r=0.9999（n=6）。结果表明，淫羊藿苷进样量在0.022～0.110 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 取对照品溶液，按拟定的色谱条件测定，重复进样6次，结果峰面积的RSD为1.89%（n=6）。表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批号的供试液，分别每隔2 h进样一次，于8 h内依法进样，结果峰面积的RSD为1.96%（n=5）。表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 按拟定的含量测定方法，对同一样品分别制备6份供试品溶液，测淫羊藿苷的含量，结果含量的RSD为1.51%（n=6）。结果表明方法重复性良好。

图1 淫羊藿苷对照品及样品色谱图

2.2.10 加样回收试验 取已知含量的样品 （淫羊藿苷含量：0.453 mg/片）6份，每份 0.25 g，精密称定，分别加入浓度为0.11 mg/ml的淫羊藿苷对照品溶液 3 ml，按“2.2.3”项下操作，依法制备，进样，测定峰面积，按公式1计算回收率。结果见表 1。

公式 1：回收率（%）=[测得量（mg）-制剂中含量（mg）]/加入对照品量（mg）×100%

表1 回收率试验结果

2.2.11 含量测定 取参芪二仙片三批样品，按“2.2.3”项下操作制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件依法测定。结果见表2。

3 讨论

本制剂中，对红参中的人参皂苷Re也进行了鉴别研究，结果斑点显色模糊，因此未纳入标准正文；含量测定中对样品的提取方法进行了对比研究，结果显示回流提取与超声提取无本质区别，因此选择较为简单的超声提取进行处理；提取溶剂选择了甲醇、50%甲醇、乙醇和稀乙醇进行比较，结果稀乙醇提取效果较好。从样品的含量测定数据可知，平均含量为0.447 mg/片，从大生产及药材来源的角度考虑，暂定本品含淫羊藿苷不得低于0.350 mg/片。最终的含量测定限度，应继续积累数据，再行确定。

表2 参芪二仙片中淫羊藿苷的含量测定结果

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