密蒙花方抑制缺氧状态下人血管内皮细胞增殖及其VEGF信号转导机制研究

吴正正 严 京 接传红 高健生 陈皆春

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是一种世界性的主要致盲眼病。本研究组在前期的实验研究中已经证实密蒙花方对缺氧状态下人脐静脉血管内皮细 胞 （human umbilical vascular endothelial cell，HU-VEC）具有明显的抑制作用 。在前期实验研究的基础上，本实验进一步从血管内皮生长因子-血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor-vascular endothelial growth factor receptor，VEGF-VEG FR）信号转导机制方面深入研究了其具体作用机制。

1 材料

1.1 试剂

RPMI 1640培养基干粉购自美国GIBCO公司；CoCl2购自 SIGMA公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司。Trizol（美国 Invitrogen）；Taq 酶、Oligo（dT）15Primer、dNTP Mix、M-MLV Reverse Transcriptase 为美国 Promega公司产品。

1.2 细胞

HUVEC细胞株购自南京凯基科技发展有限公司。

1.3 中药

购自北京燕北药材公司，经我院中药房鉴定为道地药材。黄芪（产于内蒙古），女贞子、益母草（产于河北），黄连（产于四川），肉桂（产于广东），密蒙花（产于湖北）。

2 方法

2.1 密蒙花方水提液制备

密蒙花方所含中药材沸水浴煎半小时，过滤并收集滤液，取滤渣重复提取1次，合并2次滤液。加入2倍体积的体积分数为90%的乙醇4℃过夜，离心去除乙醇不溶成分。定容至质量浓度为1 g/ml的水提液。微孔滤膜滤过灭菌。

2.2 体外细胞培养

待细胞长满融合后按1∶3分瓶传代。置于37℃、5%CO2培养箱中培养，2～3 d细胞可长满融合。用倒置显微镜观察HUVEC生长情况。

2.3 实验分组

（1）正常组：RPMI 1640 维持液；（2）缺氧组：正常组 + 终浓度 100μmol/L CoCl2；（3）密蒙花方低浓度组：缺氧组+10 mg/ml密蒙花方水提液；（4）密蒙花方中浓度组：缺氧组+20 mg/ml密蒙花方水提液；（5）密蒙花方高浓度组：缺氧组+40 mg/ml密蒙花方水提液。每组设6个平行样本。

2.4 反转录聚合酶链反应法（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测

对细胞内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA、fms 样酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase，Flt-1）mRNA、胎肝激酶-1/激酶插入区受体（fetal liver kinase-1/kinase insert domain containing receptor，Flk-1/KDR）mRNA 进 行检测。

2.4.1 细胞样本制备：10、20、40 mg/ml密蒙花方水提液分别与100μg/ml CoCl2共同孵育HUVEC 24 h后收获细胞，移至不含RNA酶的离心管中，PBS漂洗2次，加入1 ml Trizol试剂，使细胞充分裂解。-20℃冻存备用。

2.4.2 RNA的提取：在加完Trizol的细胞裂解液中加入200μl氯仿，温和振荡，室温静置，离心。吸取无色上清水相移到另一离心管，水相体积约为Trizol试剂的60%。向上清水相中加入等体积的异丙醇，室温静置。离心。去除上清，缓慢沿管壁加入体积分数为75%的乙醇，混匀，离心。吸尽上清。室温干燥沉淀，加入至30μl焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）处理过的无菌水中，完全溶解，冻存备用，待RNA鉴定。

2.4.3 反转录反应（reverse transcription，RT）：反应体系：见表1。反应条件：42℃水浴反应60 min，94℃5 min 终止反应。Oligo（dT）序列：TTT TGT ACA AGC TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT。

表1 反转录反应体系

2.4.4 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：引物设计：从Pubmed的Gene bank检索，根据软件Primer premier 5设计引物（引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成）。homo VEGF（AF_022375，245 bp）引物：上游 5’-AAT GCT TTC TCC GCT CTG-3’；下游 5’-CAT CTT CAA GCC ATC CTG-3’。 homo Flt-1（NM_002019，141 bp）引物：上游 5’-ATG CCA CGA ATG AGA ATG-3’；下游 5’-CAG ATG GAC AGC GAT GAG-3’。homo Flk-1/KDR（AF_022375，135 bp）引物：上游 5’-TCA TAA GGC AGT CGT TCA-3’；下游 5’-TCT GGC TAC TTC TTG TCA TC-3’。homo β-Actin（NM_031144.2，205 bp）引物：上游 5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’；下游 5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。 以看家基因β-Actin作为内对照进行PCR反应。反应体系：见表 2。反应条件：94℃预变性 4 min，94℃变性20 s，59℃复性 25 s，72℃延伸 30 s，进行 35 个循环，随后72℃终延伸7 min。

表2 聚合酶链反应体系

2.4.5 2.5%琼脂糖凝胶电泳：取10μl PCR产物在2.5%琼脂糖、120 V电泳30 min，观察扩增结果，进行灰度分析，以 VEGF、Flk-1、Flt-1 与 β-Actin 的光密度比值表示VEGF，Flk-1，Flt-1的表达。

2.5 统计学方法

应用SPSS13.0统计软件分析。所有结果用均数±标准差（）来表示。各组间数据比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3 结果

3.1 RNA质量鉴定结果

提取的 RNA 检测 D（260 nm）/D（280 nm）均介于1.8～2.0之间，表明RNA的纯度高。通过甲醛变性凝胶电泳结果显示28S和18S条带边缘清晰，无拖尾等现象，28S/18S约为2∶1，表明RNA样品结构完整、无降解，可进行RT-PCR扩增分析。

3.2 密蒙花方对缺氧状态下HUVEC内VEGF mRNA表达的影响

（1）与正常组相比，缺氧组VEGF mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；（2）与缺氧组相比，各密蒙花方组VEGF mRNA表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；（3）各密蒙花方组间比较，随着密蒙花方浓度的增高，VEGF mRNA表达逐渐降低，具有剂量依赖性（P＜0.01）（表 3，图 1）。

3.3 密蒙花方对缺氧状态下HUVEC内Flt-1 mRNA表达的影响

（1）与正常组相比，缺氧组Flt-1 mRNA表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；（2）与缺氧组相比，各密蒙花方组Flt-1 mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；（3）各密蒙花方组间比较，密蒙花方高浓度组Flt-1 mRNA表达较中浓度组高（P＜0.05），低浓度组与中浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表 3，图 1）。

表3 各组HUVEC内VEGF、Flt-1及Flk-1/KDR mRNA的表达情况（，n=6）

表3 各组HUVEC内VEGF、Flt-1及Flk-1/KDR mRNA的表达情况（，n=6）

注：①缺氧组与正常组比较，P＜0.01；②各密蒙花方组分别与缺氧组比较，P＜0.01；③各密蒙花方组间比较，P＜0.01；④各密蒙花方组间比较，P＜0.05。

组别 VEGF/β-Actin Flt-1/β-Actin Flk-1/β-Actin正常组 0.383±0.021 0.422±0.016 0.360±0.029缺氧组 0.642±0.043① 0.385±0.019① 0.531±0.036①密蒙花方低浓度组 0.520±0.035② 0.442±0.021② 0.484±0.019②密蒙花方中浓度组 0.480±0.020②③ 0.443±0.027② 0.451±0.023②④密蒙花方高浓度组 0.252±0.038②③ 0.486±0.024②④ 0.355±0.025②③

图1 RT-PCR法检测各组HUVEC内VEGF、Flt-1及Flk-1/KDR mRNA的表达情况A：正常组；B：缺氧组；C：密蒙花方低浓度组；D：密蒙花方中浓度组；E：密蒙花方高浓度组。Marker从上至下依次为600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp。

3.4 密蒙花方对缺氧状态下HUVEC内Flk-1/KDR mRNA表达的影响

（1）与正常组相比，缺氧组 Flk-1/KDR mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；（2）与缺氧组相比，各密蒙花方组Flk-1/KDR mRNA表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；（3）各密蒙花方组间比较，随着密蒙花方浓度的增高，Flk-1/KDR mRNA表达逐渐降低，具有剂量依赖性（表3，图1）。

4 讨论

密蒙花方是我院高健生研究员多年临床验证有效的经验方。密蒙花方是在密蒙花，交泰丸（黄连、肉桂）的基础上加黄芪，女贞子，益母草等药而成。诸药相配，具有益气养阴，和血明目的作用。本研究旨在通过体外实验研究，从细胞分子水平、信号转导机制方面探讨其具体作用机制。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前所知最强的内皮细胞选择性促有丝分裂肽和血管生成因子，既可刺激血管内皮细胞增殖及移行，也可诱导视网膜新生血管形成，同时又是强烈的致通透因子，能显著增加视网膜血管的通透性〔2〕。其表达受多种因素调控，如缺氧、胰岛素、糖基化终产物、生长因子等均可刺激血管平滑肌细胞、胶质细胞、内皮细胞等过度表达VEGF，其中缺氧是最强的诱导因素〔3〕。

血管内皮细胞主要有2种与VEGF高度特异性结合的受体：fms样酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase，Flt-1）和胎肝激酶-1/激酶插入区受体（fetal liver kinase-1/kinase insert domain containing receptor，Flk-1/KDR）。二者均为内皮细胞特异性受体，但生物学活性有所差异〔4〕。Flk-1/KDR在VEGF的信号转导及血管内皮生成中起主导作用，主要通过蛋白激酶C-有丝分裂原激活蛋白激酶（protein kinase C-mitogen activated protein kinase，PKC-MAPK）旁路促进内皮细胞增殖。Flt-1是Flk-1/KDR的一个负性调节因子，可拮抗Flk-1/KDR的促血管内皮细胞增殖作用。视网膜缺血缺氧可上调VEGF及其受体表达，从而通过激活VEGF-VEGFR信号转导通路，触发细胞内的一系列信号转导反应，诱导新生血管生成。有研究表明，阻断VEGF受体信号转导通路可阻止视网膜新生血管形成〔5〕。

本研究通过采用RT-PCR法检测密蒙花方对缺氧状态下的HUVEC细胞内VEGF及其VEGFR-1，VEGFR-2基因的情况，表明缺氧可以诱导HUVEC细胞上调VEGF及Flk-1/KDR的基因表达，下调Flt-1的基因表达，从而促进HUVEC增殖。而密蒙花方可以下调HUVEC细胞内VEGF及Flk-1/KDR的基因表达，上调Flt-1的基因表达，从而有效抑制了缺氧所诱导的HUVEC增殖。本研究说明密蒙花方抑制缺氧状态下HUVEC增殖的作用与干预VEGF-VEGFR信号转导通路有关。

信号转导是一个复杂而精确的过程，胞外信号作用于细胞膜相应受体后，可能会经胞内多条信号转导途径相互协调共同来完成信号转导任务〔6〕。在DR的发生发展中，除了VEGF-VEGFR信号转导通路的作用之外，还有其它多条信号转导途径发挥着重要作用，这与血管生成过程的复杂性一致，其信号转导过程尚待进一步深入研究。

[1]吴正正，高健生，接传红，等.密蒙花方对缺氧状态下人血管内皮细胞的作用及机理研究[J].中国中医眼科杂志，2008，18（3）：138-140.

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