转甘蔗抗虫基因CpTI的RT-PCR检测

刘洪博，姚 丽，苏火生 ，刘新龙，应雄美，蔡 青 ，吴才文

（1.云南省农业科院甘蔗研究所，开远661600；2.云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661600；3.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明650223）

甘蔗是一种重要的糖料作物，近年来甘蔗病虫害已成为制约甘蔗产量的主要因素，在甘蔗苗期，甘蔗螟虫的危害对甘蔗产量的影响较大。而常规育种途径因抗性种质资源的匮乏而难以解决。因此利用基因工程技术，将目标基因CpTI基因进行了5'添加信号肽、3'添加内质网定位信号（signal-cpti-KDEL，简称sck[1-3]）修饰，从而使基因定位在内质网上，免遭细胞内部的降解，大幅度提高外源蛋白在转基因植株中的积累水平[4]。修饰后的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（Bt）[5]和豇豆蛋白酶抑制基因（CpTI）[6]导入甘蔗，为甘蔗抗虫育种提供新材料，培育出抗虫甘蔗新品种。本研究通过前人构建的植物表达载体（含双T-DNA（transfer DNA）的双抗虫基因），借助农杆菌遗传转化到甘蔗中，对潮霉素抗性筛选出的甘蔗苗进行RT-PCR检测研究，利用sck引物对转基因植株进行CpTI基因的检测，验证CpTI基因是否固定在内质网膜上，或是被降解。

1 材料与方法

1.1 材料

通过对转基因甘蔗的抗性筛选，初步获得两个甘蔗品种的抗性植株，分别是福农94-0403和P44两个品种，一共10株抗性植株，另外取两个非转基因植株作为阴性对照，并将其转入苗床移栽，待植株长成20cm左右，取植株的正一叶和正二叶作为RT-PCR的检测材料，标记好顺序后，储存于-70℃备用。

1.2 试剂与方法

RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，反转录试剂盒TransScript First-Stand cDNA Synthesis购自全式金公司。其它试剂均购自上海生工。在提取RNA前，将所用离心管和枪头等用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后121℃高压湿热灭菌30 min，研钵、烧杯等用200℃烘箱高温干热灭菌8h。将材料从-70℃冰箱中取出，利用液氮研磨法将叶片磨碎，取50mg左右的研磨样品进行RNA提取；将提取的RNA利用琼脂糖凝胶检测和OD值分析，经检验合格后取相同含量总RNA进行反转录，RT-PCR的引物序列为:

SCK1:5'AAA ATG AAG AGC ACC ATC TTC 3'

SCK2:5'TCT AGA GTT CAT CTT TCT CAT C 3'

反转录PCR反应体系模板cDNA定量为20ng,其它PCR反应液按20μL的反应体系进行，RT-PCR的循环程序为 94℃ 5min，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 8min。 配制 1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，用全式金公司的Trans2k DNA marker作对照。

2 结果与分析

2.1 RNA提取质量分析

用TRNzol-A＋提取的RNA经过琼脂糖凝胶检测如图所示，经OD值检测表明，10个被检测样品中，RNA的OD260/OD280分别在1.80到2.01之间，表明蛋白污染较少，OD260/OD230分别在1.9到 2.3之间，表明无盐离子污染。从图1可以看出，RNA条带清晰，没有降解现象，说明RNA的完整性较好，无DNA的污染，符合cDNA合成的要求。

2.2 RT-PCR检测分析

通过对10个检测样本的RNA进行反转录后，取定量的反转录底物进行RT-PCR，结果表明：10个检测样本中，材料P44中出现一个阳性，即20号；福农94-0403出现两个阳性材料，分别为25、26号，而正常的阴性对照植株都没有出现条带，如图2所示。

图1 RNA琼脂糖凝胶电泳

3 讨论

通过对模板cDNA进行定量后，从RT-PCR的检测结果来看，CpTI基因在植株体内得到了表达，但检测的条带较弱，其中CpTI基因在P44材料中的表达较强，条带的亮度较为明显，而在福农94-0403材料中检测的两个目的基因表达较弱，条带亮度不是很明显，目的基因在植株体内表达量不是很高，从修饰的豇豆蛋白酶抑制基因来看，目的基因在转入甘蔗后并没有被降解，说明此基因整合到了细胞的特定部位，本实验采用的是已经广泛应用于玉米、小麦及水稻等单子叶中的组成型启动子玉米Ubi-1启动子，启动效率较高，并从检测的两种材料来看，可能目的基因的表达量与转基因受体材料有关，也可能在目的基因转入甘蔗中，整合的部位不同，从而受到影响。

图2 转基因植株RT-PCR检测电泳

4 结论

RT-PCR在转基因植株的检测中具有重要的意义，它可以作为转基因植株抗性筛选后的初步检测，与总DNA的PCR检测方法相比，RT-PCR能够更准确的在表达水平上检测目的基因，在底物固定的条件下，还能够相对检测出目的基因在植株体内的表达水平。本实验利用RT-PCR所检测出的3个转基因植株，证明CpTI基因已经成功转入植株，并已经得到表达；在相同底物的前提下，PCR产物量有所不同，证明相同的目的基因，在材料P44中的表达量较高，而在材料福农94-0403中的表达量较低，PCR的条带较暗。但RT-PCR在证明目的基因在植株体内表达功能具有一定的局限性，因此，本实验的3株转基因植株还需要进一步的验证其功能的表达。

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