基因芯片技术分析血管紧张素原基因多态性与冠心病的关系

马 娟，李勇国，王 玮，田 青

（昆明市第一人民医院 心内科，云南 昆明 650011）

冠心病(CHD)是由遗传和环境因素共同作用所致的复杂疾病。国外的研究大部分表明AGT基因变异与CHD具有相关性[1]，T等位基因是CHD发病的危险因素，但也有一部分人认为二者无关[2]，少数人则得出相反的结论[3]。我国对于二者关系的研究甚少，结论尚存在争议。本研究应用基因芯片技术检测AGT基因的M235T多态性，并比较其基因型及等位基因频率，旨在探讨人群AGT基因多态性和CHD的关系。

对象与方法

对象：2005～2006年期间昆明市第一人民医院心内科收住的CHD患者100例，符合关于缺血性心脏病的命名和诊断标准，其中45例确诊为冠心病，急性心肌梗死(AMI)，23例诊断为冠心病，心绞痛型，12例诊断为冠心病，缺血性心肌病，成功完成基因检测90人，均为冠状动脉造影证实冠状动脉病变患者，男62例，女28例，平均年龄(60.01±12.40)岁。同期100名对照组，成功完成基因检测79例，男44例，女35例，平均年龄(64.27±11.28)岁，均行冠状动脉造影术无冠脉病变。

方法：采用基因芯片检测技术，结合PCR体外扩增方法，检测人类冠心病相关基因AGT基因235的多态性情况。⑴标本采集采集被检者静脉血0.5ml，用一次性无菌注射针头抽取，收集于含50μl的2%EDTA溶液的无菌1.5ml离心管中，盖上管盖，上下颠倒数次使混匀。⑵存放上述血样在2℃～8℃保存，保存期不应超过3周；在-20℃保存期半年，-80℃可长期保存，但严禁反复冻融。⑶采用适用0.2ml扩增管并有热盖的PCR扩增仪。⑷在芯片杂交过程中采用温控精度为±0.5℃的恒温设备（BaiO FLWS-526全自动杂交仪）进行杂交。⑸在芯片杂交信号检测时采用BaiO BE-2.0生物芯片识读仪。图像Array Docctor软件分析可自动输出检测结果，最后检测出AGTM235T基因的多态性位点。

质量控制：每次检测中都应设置阴性、阳性、对照品。产品检测过程中，若软件对“标志列、阴性、阳性对照”3者进行判断后，输出其中之一为“不合格”，则实验无效。

结果判断：由软件自动判断并输出结果，当软件判断标志列、阴性、阳性对照均合格时，会自动输出检测结果。其中，“+”表示对健康不利的基因纯合子，“±”表示基因杂合子，“-”表示对健康有利的基因纯合子。

统计学分析：⑴首先应用SPSS11.0软件包作统计学处理。AGT基因型和等位基因频率之间的比较用χ2检验，同时计算优势比(OR)及95%可信区间（95%CI）。⑵对所选病例进行多元Logistic回归统计学分析，以各危险因素（性别、年龄及基因型）为自变量，通过冠脉造影确诊为冠心病组、正常对照组为因变量，构建二分类Logistic回归模型，对各危险因素进行筛选，选择Backward LR法（后退法，似然比检验）建立模型，进入水准为α＝0.05，剔除水准β＝0.10（见表1）。

表1 冠心病的可能危险因素与赋值

结 果

对入选患者进行一般临床资料分析，病例组和对照组除了在年龄（P＝0.016） 及性别构成（P＝0.003） 的差异有统计学意义，其它指标均无统计学差异（见表2）。

表2 一般临床资料在两组中的分布

CHD组与正常对照组A GT基因M235T多态性检测：CHD组及对照组的基因型频率适合度检测，显示皆达到Hardy-werberg平衡。CHD组AGT-TT基因型频率(45.9%)与对照组组(28.8%)基因型频率比较，差异有统计学意义（χ2＝9.87，P＝0.007），TT型基因型与CHD呈正相关。2组T等位基因频率分别为75%（CHD组）；61%（对照组），差异有统计学意义 （χ2＝6.701P＝0.01 OR＝0.541，CI＝0.339-0.864），见表3。

对性别、年龄及基因型进行多元Logistic回归：结果，男性患者患冠心病的可能性是女性患者的3.775倍；年龄每增加10岁患冠心病的可能性就增加1.663倍。多携带一个T等位基因患冠心病的可能性就增加2.508倍（表4）。

表3 AGT基因M235T型基因型频率的分布（%）

表4 方程中变量的检验情况

讨 论

近年来由于研究手段的进步，人们开始对基因多态性等内部因素给予更多地关注，其中AGT基因M235T多态性与CHD的关系倍受重视[5]。国内外研究普遍认为AGT基因多态性可以改变血浆AGT水平[4]，血浆AGT水平随235T等位基因数量的增加而增加。而血浆AGT的增加又可引起血管紧张素（Ang）Ⅱ水平的过度增高，从而使血压升高，心脏后负荷增加，导致心肌肥厚。AngⅡ的过度增高还可使内皮功能失调，诱发心肌缺血及粥样斑块破裂。也可使低密度脂蛋白在血管壁滞留，氧化及被吞噬细胞吞噬，这些对CHD发生发展都具有促进作用。Katsuya等[5]对422例冠心病患者和406例无冠心病的正常对照组进行了AGT基因M235T多态性的调查，发现AGT基因的T/T基因型频率在冠心病组显著高于对照组，经Logistic回归分析表明，AGT基因的T/T型是冠心病的独立危险因素。Ishigami等[6]对日本人的AGT基因类型检测发现冠心患者中T/T基因型频率为65.9%，显著高于正常对照组的49.3%。陈德等[7]在上海地区研究结果提示AGT基因M235T变异可使中国人群MI的发病危险性增加。但是也存在一些不同的研究结果，Arnett等的研究结果为AGT基因的M235T变异与动脉粥样硬化和动脉壁增厚无相关性[8]。此外，AGT基因M235T多态性的各基因型频率在不同种族人群中的分布有较大差异。T等位基因频率在白人中一般为0.35～0.45，在日本人中为0.6～0.7，美洲黑人中可达0.84～0.93[4]，中国汉族人群为0.65[9]。O-livieri[10]发现AGT 235T等位基因频率在亚洲与高加索人群中有相当大的差异，分别为0.63～0.79，0.35～0.41。他从对日本和中国人群研究的结论均有争议中推断出，人群中种族的变异也可以导致基因型结果的不同。

本实验研究结果显示，CHD人群和正常人群的AG M235T分子变异差异有显著性。90例CHD患者和79例非冠心病患者AGT基因M235T TT型差异有显著性，两组T等位基因频率差异有统计学意义，提示该人群中AGT基因M235T多态性与CHD发病有关，经多因素Logistic回归分析表明：T等位基因是CHD发病的危险因素，多携带一个T等位基因患冠心病的可能性就增加2.508倍，本研究结论与中国大陆相关报道相似[7]，而与台湾地区报道有差别[11]，支持Olivieri推断。男性患者患冠心病的可能性是女性患者的3.775倍；年龄每增加10岁患冠心病的可能性就增加1.663倍。

随着分子生物学技术的发展，国内外学者越来越多地致力于寻找CHD与某些基因多态性之间的关系，试图揭示CHD的最终发病机制。不同的结果也许与病例选择、种族、研究方法都有关系。因此，在今后的研究中应注意候选基因的选择要有明确的病理生理学基础；候选基因多态性对其编码的蛋白质具有功能影响；采用更加合理的检测方法；正确选择研究对象，深入研究基因与基因。基因与环境之间的相互作用及基因型与表型的联系等，对进一步明确多基因相关性疾病具有重要意义。基因芯片技术通过碱基互补配对原理进行杂交，然后通过检测探针分子杂交信号强度，获得样品中大量基因序列及表达的信息，其特点是高效、快速、自动微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性，有着广泛的应用前景。及早对具有冠心病易感基因的人群进行有关健康饮食和生活习惯的宣传和筛查，将可降低该人群冠心病的发病率和死亡率。而且因病人的遗传背景不同，将来可能有望根据不同基因型进行冠心病个体化预防、治疗和随访。

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