昆明地区单采血小板献血者HPA1-17系统基因多态性的分析

朱祥明，杨通汉，姚富柱，汤 戎，赵 杨，苏品璨，罗 臻，涂源泉，郭 萍，姚 杰，李开红

（昆明血液中心，云南 昆明 650106）

人类血小板同种抗原（human platelet alloantigen,HPA）是分布在血小板糖蛋白上一类特异性抗原，又称血小板特异性抗原。由于HPA的不配合而产生的血小板抗体可以导致新生儿同种免疫血小板减少症（NAITP）、输血后紫癜（PTP）以及致血小板输注无效（Platelet Transfusion Refractoriness,PTR），给患者带来巨大的经济负担，这是临床和输血领域共同遇到的重要问题[1-5]。

研究不同地区人群的HPA频率，建立已知型地区性血小板献血者资料库，可大力解决因血小板同种免疫造成的血小板输注无效及输血后紫癜的难题，具有重要的临床指导意义[6]。

作者对1000名无血缘关系的自愿无偿单采血小板献血者做HPA-1-17等位基因进行分析。获取了昆明地区人群HPA-1-17基因频率，建立了的已知型血小板献血者基因数据库，为解决昆明地区血小板同种免疫输注难题及血小板同种免疫疾病诊断奠定了基础[7-9]。

对象与方法

一、研究对象 1000名昆明地区无血缘关系固定无偿单采血小板捐献者，汉族，年龄18～50岁，每名志愿者采集外周静脉血5ml。

二、试剂及仪器 5%EDTA-Na2，ST系列一次性真空采血管（北京批号：071020）；TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技，批号：H6820）；TaqDNA聚合酶（Roche公司，批号：06077E）；血小板同种抗原1-17基因分型检测试剂盒（天津，批号：1001A）所用试剂均在有效期内，严格按照操作说明书使用。超微量核酸测定仪 （Thermo Biomate3），9700PCR扩增仪（ABI公司），电泳仪（AB gene公司），凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。DNA制备严格按照试剂说明书提取DNA，并采用核酸测定仪测定DNA浓度，并调定至 （50～150） ng/μl，纯度A260/280=1.6-1.9。

三、基因分型（HPA1-17分型） 1.PCR扩增体系及条件 扩增体系每人份用量中包括：140μl浓缩dNTP-Buffer+180μl去离子水+3.3μl-Taq 酶(5U/μl)+50μl样品DNA 共373.3.7μl混合液，分别向34个引物孔各加入上述混合液。扩增条件为：96℃，2min；96℃ 20s，70℃ 60s，8个循环；96℃ 20s，64℃ 50s，72℃ 45s，10个循环； 96℃20s，61℃ 50s，72℃45s扩增20个循环，最后72℃延伸5min。最后4℃保存。

2.凝胶电泳 PCR产物分析采用TBE缓冲液制备的3%琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色,150V电泳10分钟后紫外灯下拍照记录。

3.结果判断 在紫外透射下，出现内照带表示PCR扩增成功，有特异扩增产物条带的反应为阳性。对照反应格局图，判定HPA1-17基因型。

4.统计学分析 HPA基因命名参照[10]。HPA采用方根法由表型频率估计基因频率[11]：抗原频率（f）i=阳性抗原数/N，基因频率(gf)=1－（fi为表型频率，N为观察数，gf为基因频率）。HPA不配合率=(1-P)2×P(F为表型频率)。基因型观察值与期望值之间的吻合度采用Hardy-Weinberg平衡检验。

结 果

经PCR-SSP检测，1000名血小板献血者均得到HPA1-17抗原34个等位基因电泳结果，详见表1-2，随机选3个样本，举例如图所示（见图1、2、3）。

样本1的基因型为：1a/1a，2a/2a，3a/3a，4a/4a，5a/5a，6a/6b，7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15a,16a/16a,17a/17b

样本2的基因型为：1a/1a,2a/2a,3a/3b,4a/4a,5a/5a,6a/6a,7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15a,16a/16a,17a/17b

样本3的基因型为：1a/1a,2a/2a,3a/3a,4a/4a,5a/5a,6a/6a,7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15b,16a/16a,17a/17b

本次研究中，昆明地区汉族人群血小板献血者HPA1-17基因和基因频率见表4，每个样本均检测 到 HPA-1a， 2a， 4a-14a， 16a， 17a 基 因 ；HPA-4a，7a-14a，16a，17a呈现单态性，未检测出相应的等位基因HPA-b;对于HPA-1、-2、-5、-6主要以a/a纯合子为多，a/a基因型频率分别是0.989、0.96、0.99、0.98，没有b/b纯合子出现。在HPA1-17中，具有最高杂合度的是HPA-15，基因型HPA15a/15a，HPA15a/15b，HPA15b/15b 频率分别是0.392、0.36、0.248；HPA-3在其次，基因型HPA3a/3a，HPA3a/3b，HPA3b/3b频率分别是0.339、 0.467、 0.194。 经 χ2检 验 ， 结 果 符 合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（见表1）。

本次研究为国内外类似报道中，首次完整地检测了血小板献血者HPA1-17基因遗传多态性，与国内外的一些HPA群体遗传学部分数据进行统计学χ2检验，结果见表2。

讨 论

血小板抗原具有高度多态性，它的多态性是由位于血小板糖蛋白上的单个碱基取代而导致相应氨基酸的改变而产生的。随着分子生物学技术的不断发展和对人类血小板抗原基因结构研究的不断深入，使得血小板抗原的检测方法由传统的血清学方法发展为以DNA为基础的HPA基因分型方法。本文采用PCR-SSP对昆明地区1000名自愿单采血小板献血者进行HPA1-17系统进行了基因分型，结果提示了昆明地区献血者HPA1-17基因型和等位基因频率分布概况，为建立已知型血小板献血者库和血小板配合性输注提供实验依据。

HPA抗体虽不是引起血小板输注无效的最主要免疫因素[21]，但是患者一旦产生抗HPA抗体，其所导致的血小板输注无效将非常严重[22]。本次研究的HPA结果与国内外不同地区及国家相比，基因频率不尽相同（表2），其中HPA-3a系统与我国其他城市、亚洲国家和地区（日本、台湾、泰国）相似，而与英国、美国人种有较大差异。HPA-15a系统频率与重庆、广州报道相似；而与青岛、台湾、英国、美国等地的报道有较大差异。本次调查结果再次证实HPA-3、15在中国汉族人群中具有较高遗传多态性，在临床输血实践中是最为重要血小板抗原系统。对HPA抗原作基因分型，在血小板同种免疫引起的NAITP，PTP以及PTR的诊断中，具有重要的临床意义[23]。

本次研究表明昆明地区汉族血小板献血者HPA1-17基因频率与南方汉族接近，也呈现其自身的特点。随着输血技术的发展和成分输血的普及，血小板减少症患者接受单采血小板输注，可减少出血的危险，有效提升血小板计数，单采血小板的输注也逐渐被广泛应用于临床。由于血小板输注的局限性，目前临床上输注单采血小板时，仍采用随机化的方法（即ABO血型相合性输注，未经血小板血型交叉配合相合） 输注，因而可能被血小板同种抗原免疫致敏，主要产生抗HLA-Ⅰ和抗HPA。选择HLA配合的血小板，或HLA及HPA都配合的血小板，是减少免疫性血小板输注无效的较为理想的方法[24,25]。通过对某地区人群HPA的筛查，可掌握该区域人群中HPA基因型分布情况，为临床上需要输注血液或成分血的患者提供相匹配的血液制品，提高血小板输注的安全性和有效性。本次调查的1000名的单采血小板献血者HPA基因频率,，经分析符合Hardy-Weinberg遗传平衡，证明结果是可信的。据此建立的血小板献血者基因库，不仅可为昆明地区人群制定血小板同种免疫性疾病的筛选计划提供根据，而且可为探索民族起源、遗传、迁徙及法医个体识别提供科学数据[26]。

表1 昆明地区单采血小板献血者HPA1-17基因型和基因频率分布

表2 昆明地区单采血小板献血者HPA1-17基因分布特点与其它种族、地域间的群体比较

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