DNA高甲基化与肿瘤的研究进展

李灿美 综述 杨 凌，曾 云 审校

（昆明医学院第一附属医院 血液科，云南 昆明 650032）

在哺乳动物DNA分子中，DNA甲基化是指甲基（-CH3）在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs） 催化下，共价结合到DNA分子的胞嘧啶（C）碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的表观遗传学修饰过程。DNA甲基化发生在DNA复制完成之后，因此不改变DNA序列，是一种可逆的变化[1]，是通过影响基因的表达以改变其功能。DNA异常甲基化分为DNA高甲基化和DNA低甲基化。研究证实，在肿瘤的发生发展过程中DNA高甲基化比低甲基化更为常见。DNA高甲基化是癌变过程中早期的分子异常之一,也是早期发现肿瘤的潜在生物学标志，其对肿瘤患者的早期检测、治疗和预后等都有重要意义。因此，本文将对DNA高甲基化与肿瘤的相关研究进展进行综述。

一、DNA高甲基化产生的原因

导致肿瘤高甲基化模式改变的机制尚不清楚，其可能和以下因素有关：⑴保护胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤岛（CpG岛）免受甲基化因子的丢失。在正常细胞中，多数基因启动子区通常处于非甲基化状态，这可能和一些保护性因子如反式作用因子等的存在有关。Butcher等[2]报道：反式作用因子与CpG岛起始点的Sp1位点结合可防止乳腺癌易这个结果提示某些反式作用因子可保护CpG岛免于甲基化。因此，在感基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1） 启动子甲基化，缺乏CpG岛保护因子的情况下将导致甲基化状态的出现。⑵肿瘤中DNMTs的过度表达。研究发现DNMTs,尤其是DNMT1在肿瘤组织中表达水平升高,这提示DNMTs与肿瘤中的甲基化异常有关,并参与肿瘤的发生发展。⑶DNMTs复合物受到破坏，即指DNMTs酶的抑制成分的调节失控，该失控可能与DNMTs形成复合物的一种或几种因子如：视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），DNA甲基转移酶1相关蛋白-DNA甲基转移酶结合蛋白（DMAP1-DNMT结合蛋白）的丢失所致。⑷基因组各部分复制时序性的破坏。基因组的复制在细胞周期S期通过空间和短暂模式得以实现。在此过程中的变化使复制区域和染色质构成的区域无法正常地相互作用。CpG岛可能通过复制时序紊乱发生异常甲基化。

二、DNA高甲基化导致肿瘤发生的机制

在正常状态下基因启动子区的CpG岛一般是非甲基化的，当其发生高甲基化时，常导致抑癌基因、DNA修复基因等转录沉默，使之功能丧失，从而导致正常细胞的生长分化调控失常以及DNA损伤不能被及时修复，这与多种肿瘤形成密切相关。

1.信号转导通路基因高甲基化：蛋白质酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1） 是造血细胞信号转导的基本负调控因子，90%的成人T淋巴细胞白血病，90.9%的自然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤，60.5%的急性淋巴细胞白血病，90.0%的急性髓系白血病，100%的慢性粒细胞白血病的患者标本中有SHP-1基因CpG区域高甲基化[3]。Yang等[4]研究51例肝细胞癌组织中多个相关基因的甲基化状态，结果多基因发生甲基化：细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）（65%），谷胱甘肽S-转移酶 P（GSTP）（54%），促后期复合物（APC）（53%），E-钙粘蛋白（CDH1）（49%）及 p15（49%），其中 53%的肝细胞癌有2个以上的基因高甲基化，而在正常组织中为0%。证明，SOCS1等的高甲基化是肝细胞癌发生过程中的普遍事件，且对肿瘤形成起到重要作用。

2.抑癌基因高甲基化：研究发现抑癌基因p16的失活通常都采用CpG岛高甲基化的作用机制。高甲基化导致p16基因失活是肿瘤中经常发生的事件之一。Celebiler Cavusoglu等[5]对p16和CDH1的研究表明，浸润性乳腺癌的肿瘤组织和其周围正常的乳腺组织在这2个基因中的甲基化表达存在差异而这种差异还存在于在肿瘤周围的正常乳腺组织和无肿瘤的正常乳腺组织之间。研究发现，在许多血液肿瘤中可以检测到抑癌基因p15的高甲基化。如：Martin等[6]发现p15基因的异常与浆细胞疾病有关，在多发性骨髓中p15基因高甲基化是重要的事件；在各种类型的急性白血病、慢性髓细胞性白血病、前髓性白血病、成淋巴细胞性白血病和淋巴瘤中都有p15基因启动子区的甲基化。

3.DNA修复基因的高甲基化：在肿瘤中，可以发现参与DNA修复的基因常由于启动子区高甲基化而失活。如：DNA修复基因O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-MGMT）近来的研究证明存在于该基因启动子区或第一外显子内的CpG岛甲基化与其转录失活有关，而且这种变化可以使染色质进入关闭状态，进而导致核小体定位异常。该变化不仅存在于细胞系中，也发生在原位癌中，在肺癌、乳腺癌、大肠癌和淋巴瘤细胞系中O6-MGMT启动子出现高甲基化。研究证明，BRCA1发生高甲基化可能与DNA双链断裂，转录和重组修复有关，这一理论在乳腺癌和卵巢癌中都得到证实[7]。

除上述基因外，还发现其他一些基因，如凋亡基因（死亡相关蛋白激酶（DAPK[8]），视黄酸受体 β（RAR-β），微小 RNA （miRNA）[9]，血管生成抑制基因（THBS1）[10]等在不同肿瘤中存在着高甲基化现象。提示肿瘤的发生与不同基因发生高甲基化有关，其具体机制有待进一步研究。

三、DNA高甲基化的临床意义

随着在癌症的发生发展中DNA甲基化异常现象的发现，且此现象在确诊前就能被检测出，提示某些基因的DNA高甲基化水平的检测有望成为肿瘤早期诊断的潜在指标，甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的指标。同时，DNA甲基化是可逆的，因此，使用去甲基化剂使得甲基化的基因因去甲基化而重新活化表达，为肿瘤的治疗提供了新的方法。

1.DNA高甲基化与肿瘤的早期诊断：随着甲基化检测技术的发展，特别是甲基化特异性PCR（MSP）技术，使我们能够对临床上的微量样本进行检测，如血浆、唾液、痰液等。因此，人们已开始探讨以体液DNA作为DNA甲基化临床分析样品，期望可早期诊断肿瘤，如采用大便进行结肠癌诊断分析，痰液诊断肺癌，取血清或血浆DNA诊断各种实体肿瘤[11]。有报道p16INK4a在肺癌发病早期（轻度异型增生阶段）其启动子CpG岛即呈高甲基化状态。Palmisano等报道，在临床诊断肺鳞癌的前3年，他们就在患者的痰液中检测出p16和O6-MGMT基因甲基化。因此，痰液中某些基因的异常甲基化可作为临床筛查肺癌高危人群的一个指标。因此，随着研究的不断深入，DNA高甲基化将在肿瘤的早期诊断方面发挥重要作用。

2.DNA甲基化与肿瘤预后判断：随着对甲基化与肿瘤发展相关性研究的不断深入，人们逐渐认识到，甲基化改变与传统的预后指标之间存在密切联系。主要包括以下4个方面：⑴甲基化改变与肿瘤分级、分期有明显的相关性。如Ras相关区域家族1A（RASSF1A）甲基化在低分化肺癌中比在高分化中更常见，在结直肠癌Dukes分期C和D的病例中p16的甲基化率比A和B的高。⑵DNA异常甲基化可促进肿瘤的侵袭和转移。乳腺癌中细胞周期素蛋白D2（CyclinD2），RAR-β，RASSF1A和HIN-1（high innormal-1） 的甲基化改变与淋巴结、骨、脑、肺转移有关。⑶甲基化可作为肿瘤复发的独立预测因子。如口腔鳞状细胞癌时存在 RECK（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs） 基因甲基化的患者复发率明显增高[12]。⑷甲基化影响生存期。Fischer等[13]研究了恶性间皮胞瘤中3个基因的甲基化情况，发现多基因较单个基因甲基化预后更差。膀胱癌中APC，GSTP1基因发生异常甲基化时，患者存活时间明显缩短。可见检测甲基化的改变有助于判断预后，进而为临床上的病情监控和风险评估提供依据。

3.DNA甲基化谱的建立和意义：Esteller等[14]对以往有关甲基化的部分工作进行了分析，发现根据肿瘤类型可以建立CpG岛甲基化图谱。肿瘤细胞在很大程度上保持其细胞谱系的特征（基因表达和甲基化模式），故对肿瘤细胞DNA甲基化谱式的分析将为确定肿瘤组织来源提供必要的信息。因此，人类表观遗传协会（HEC）于2003年提出和开始实施全面揭示人类基因组所包含的表观遗传学完整信息，绘制人类基因组甲基化可变位点 （methylation variable positions，MVP） 图谱。以MVP为代表的表观基因组图谱，将有助于了解基因调控，以及正常和疾病状态下不同基因相互作用的千丝万缕关系。它不仅可为肿瘤等疾病的深入研究提供新的诠释依据，而且，与其他基因组技术联合应用，还可深入到药物研究，此外，DNA甲基化筛选还可为疾病状态提供新的表观遗传学标记，为药物研发挖掘新的标靶。

4.甲基化在临床治疗上的应用：由于DNA甲基化不涉及到DNA序列本身的改变，所以这种改变是可逆的，因此，使用去甲基化剂使得甲基化的基因因去甲基化而重新活化表达。研究已证实去甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷（5-aza-CdR） 在体内、外均可使大多数高甲基化的抑癌基因去甲基化恢复表达而抑制肿瘤。Momparler等[15]报道5-Aza-CdR在患有白血病、骨髓增生异常综合征（MDS）、非小细胞性肺癌（NSCLC）的病人中进行了1期、2期临床试验，显示了一定的抗肿瘤作用，可以提高一部分患者的生存率。因此，5-aza-CdR和5-氮-2'-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine），于2007年获得FDA批准用于MDS患者的治疗[16]。目前在国外5-aza-CdR是治疗MDS推荐的一线药物[17]。Miasaki等[18]研究显示5-aza-2-deoxycytidine治疗后的甲状腺癌细胞系，维甲酸受体beta2重新表达和生长抑制。Fan等[19]研究结果显示联合应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和DNMTs抑制剂可以恢复ERalpha阴性乳腺癌细胞株对内分泌治疗的敏感性。Yang[20]等用三氧化二砷处理淋巴瘤T2细胞株，使SHP-1基因去甲基化而再表达。因此，在肿瘤和癌前病变中通过去甲基化处理可以恢复某些关键性抑癌基因的功能，从而起到预防和治疗肿瘤的作用。所以，在将来，DAN甲基化抑制剂将作为抗癌制剂在肿瘤治疗中发挥重要作用。

当然对这些药物的作用和副作用还需要进行更深人的基础和临床试验研究，因为广泛应用去甲基化药物可以启动一些使细胞恶性转化的基因。

四、尚待解决的问题和展望

目前，DNA甲基化导致转录失活的机制已基本明确，但恶性肿瘤中DNA甲基化改变的原因尚未完全清楚。不同的恶性肿瘤中可能存在不同的甲基化谱，同一肿瘤的癌前病变、早期癌以及中晚期癌的甲基化谱有无改变，尚不得而知。虽然DNA高甲基化与肿瘤发生的关系较明确，但肿瘤发生是一个多因素、多阶段、多基因的复杂过程。DNA高甲基化如何与其它致癌因素协同作用促进肿瘤发生仍需进一步研究。由于目前已知的与肿瘤相关的甲基化基因数量非常庞大，所以，即便CpG岛甲基化谱具有肿瘤特异性，且大多数肿瘤都有多个独立的启动子甲基化事件，建立合理的多指标甲基化图谱就能为评估肿瘤风险、早期诊断以及肿瘤预后提供有用信息，但如何既经济又有效地对细胞全基因组甲基化状态进行检测，早期发现异常甲基化的DNA，也成为DNA甲基化研究中一项非常重要的工作。

同时，目前对疾病诊断的金标准仍然是依靠病理组织学的诊断，但这需要手术或活检来获得标本，而获得这些标本的过程均是有创的，因此对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者，有创检查对于早期发现和筛选肿瘤不适用。肿瘤相关基因启动子异常甲基化是细胞癌变过程中的一个早期事件，可以作为肿瘤发生的敏感性生物标志物。因此，如何有效地利用比较容易获得一些生物样品如外周血的血浆/血清、唾液、痰、尿、粪便等来检测肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子高甲基化，是医务工作者的当务之急和研究方向。

尽管，体外实验已证实甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR通过去甲基化作用可使多种CpG岛高甲基化的抑癌基因重新表达而恢复抑癌功能。但是这些药物均无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而会引起整体的低甲基化；这类药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在；同时在大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用。因此，我们还应该在逆转基因甲基化的特异性、疗效的持续性、可控制性等方面进一步研究。

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