依达拉奉联合奥扎格雷对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机制的研究

徐凤鸣，刘志明

（曲靖市第一人民医院 神经内科，云南 曲靖 655000）

缺血性脑血管病约占全部脑血管病的80%，其发病率、致残率和病死率高，已成为严重危害人类健康的疾病之一[1]。如果在时间窗内（6h） 血流迅速恢复，神经细胞仍可存活并恢复功能，如超过时间窗，脑血流再通后可产生再灌注损伤，使脑损伤加剧，是脑缺血后脑功能障碍的主要因素。本实验观察依达拉奉联合奥扎格雷对大鼠脑缺血再灌注损伤后的保护作用，取得满意结果，现总结如下。

材料与方法

一、实验动物：健康雄性青壮年SD大鼠50只，购自昆明医学院动物实验中心，体重280～350g，术前12h禁食，自由活动。

药品及试剂：依达拉奉注射液购自南京先声东元制药有限公司，奥扎格雷注射液购自武汉远成共创科技有限公司，IL-1，TNF-α购自武汉博士德生物工程有限公司。

二、动物分组及给药方法：将50只SD大鼠随机分为5组，即假手术组、缺血/再灌注组、生理盐水对照组、奥扎格雷组和依达拉奉联合奥扎格雷组。奥扎格雷组在缺血前30min和再灌注后立即将奥扎格雷8mg·kg-1腹腔注射。依达拉奉联合奥扎格雷组除注射相同剂量的奥扎格雷外，同时注射依达拉奉3mg·kg-1。对照组以相同时间相同剂量的生理盐水腹腔注射。

三、缺血/再灌注组模型制备：根据Traystman[2]在脑缺血动物模型综述中介绍的线栓法栓塞SD大鼠左侧大脑中动脉制备脑缺血模型。缺血2h后将尼龙线拉至颈总动脉分叉处，即实现了再灌注，再灌注时间为12h。假手术组仅分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉、不插入尼龙线。大鼠苏醒后观察右侧肢体运动障碍（前爪不能伸展、爬行时向右侧转圈）即为模型制备成功。

四、神经功能缺损评分：线栓法一般多采用改良Longa评分，评分标准为，0分：无神经功能缺损症状；1分：不能伸展对侧前爪；2分：身体向对侧转圈；3分：身体向对侧倾倒；4分：意识丧失，不能自发行走。

五、脑梗死面积的测定：缺血2h再灌注12h后，迅速将大鼠断头取脑，将前脑冠状切成1.5mm厚的脑片，于0.5%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液中37℃水浴孵育染色15min后，取出用10%的甲醛溶液固定。染色后正常组织呈白色，梗死组织呈红色。利用Photoshop图像分析软件观测梗死范围，通过测量梗死体积来衡量脑缺血的严重程度。

六、生化指标的测定：将大鼠断头取脑，将大脑置于匀浆器中，制成脑组织匀浆。采用Lawry法蛋白定量，加入等容积的0.1mol/L稀醋酸混匀，4℃时4000r/min离心15min，取上清用放免法测定IL-1，TNF-α的含量（ng/ml），然后换算成（ng/mg）组织蛋白。

七、统计学处理：所有计量资料以均数±标准差表示，应用统计软件SPSS12.0两组间样本比较用t检验，多组间数据的比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、5组大鼠神经功能Longa评分的比较及依达拉奉联合奥扎格雷对神经功能的影响：除假手术组外，其它4组脑缺血/再灌注后，均出现了大鼠神经功能缺陷，依达拉奉和奥扎格雷可降低大鼠神经缺陷评分，与脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组比较差异有显著性（P＜0.05），见附表。

二、5组大鼠脑梗死面积的比较及依达拉奉联合奥扎格雷对脑梗死面积的影响：除假手术组外，其它4组脑缺血/再灌注后，均出现了大鼠脑组织梗死，依达拉奉和奥扎格雷可降低大鼠脑梗死面积，与脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组比较差异有显著性（P＜0.05），见附表。

三、5组大鼠脑组织生化指标的比较及依达拉奉联合奥扎格雷对IL-1，TNF-α的影响：假手术组几乎无IL-1，TNF-α因子的表达，脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组IL-1，TNF-α3h后开始升高，6.5h后达高峰后又逐渐下降；奥扎格雷组IL-1含量与脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组无显著性差异（P＞0.05） ,TNF-α含量明显下降，有显著性差异（P＜0.05）；依达拉奉和奥扎格雷组IL-1，TNF-α含量均下降，与脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组比较均有显著性差异（P＜0.05），见附表。

讨 论

脑缺血再灌注的机制已经有比较深入透彻的研究：在局部血管闭塞后，血流下降最严重的梗死中心区细胞迅速死亡，周围的缺血半暗带区的血流出现不同程度的下降，半暗带区细胞死亡包括坏死和凋亡两种机制。缺血级联反应：缺血→无氧代谢→pH下降→酸中毒→Na+-K+泵衰竭→细胞膜去极化→Mg+阻滞消除→兴奋性毒性谷氨酸盐释放→NMDA、AMPA受体和代谢型受体激活→钙内流超载→细胞内钙调蛋白酶激活→NO产生过量→氧化应激反应，自由基形成→基因表达改变→坏死、凋亡。在缺血级联反应中每个环节都可以成为保护性治疗的靶点。其中自由基损伤目前认为是导致水肿形成和细胞凋亡的主要原因。自由基可激活炎性细胞因子和酶，导致小胶质细胞激活 （Microglial activation） 产生炎症反应，IL-1，TNF-α主要来源于小胶质细胞，因此脑缺血再灌注后IL-1，TNF-α表达明显增加，与脑组织的损伤程度呈正相关。IL-1是脑缺血再灌注损失的免疫炎症反应的基础，是多种炎症介质失控释放而形成的“瀑布效应”的起始因子，可参与神经损伤毒性，促进自由基释放，诱导发热，降低脑血流[3]。TNF-α在缺血再灌注损伤中的作用机制主要诱导了细胞间粘附分子（ICAM-1） 表达，引起血管炎性反应，使血液中TXA2活性增加而导致强烈的血管收缩和血小板聚集，促进血栓形成和血管堵塞，加重脑缺血。对脑缺血动物模型预先给予IL-1，TNF-α抗体，可显著降低脑缺血再灌注损伤，本实验中缺血再灌注组IL-1，TNF-α变化与上述相符，证明IL-1，TNF-α在缺血性脑损伤发生发展中起重要作用，提示通过各种方法拮抗IL-1，TNF-α有可能成为治疗脑梗死的新途径。奥扎格雷是高选择性的TXA2合成酶抑制剂，抑制TXA2的产生及促进前列环素的生成[4]，从而抑制TNF-α的表达，扩张脑血管，增加大脑缺血区的血流量，使受损的脑组织功能恢复，本实验结果显示奥扎格雷组IL-1含量与脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组无显著性差异（P＞0.05），TNF-α含量明显下降，有显著性差异（P＜0.05）；证明奥扎格雷可能是通过抑制了TNF-α的表达来发挥脑保护作用的，对IL-1的表达无明显影响。

依达拉奉是捕获羟自由基的活性氧化剂，可抑制小胶质细胞激活表达IL-1，TNF-α，对梗死周边区域血流量减少有抑制作用，并通过抗氧化，减轻脑水肿，抑制迟发性神经元死亡，保护脑组织[5]，还能防止血管内皮细胞损失，发挥抗缺血作用[6]。本实验结果显示假手术组几乎无IL-1，TNF-α因子的表达，脑缺血/再灌注组及生理盐水对照组IL-1，TNF-α3h后开始升高，6.5h后达高峰后又逐渐下降；通过依达拉奉联合奥扎格雷治疗后脑组织中IL-1，TNF-α含量明显减少，说明依达拉奉和奥扎格雷可以抑制IL-1，TNF-α激活和分泌，从而抑制炎性反应，减轻再灌注损伤。

附表 各组神经功能、脑梗死面积、IL-1及TNF-α

本文通过奥扎格雷联合依达拉奉治疗大鼠急性脑缺血再灌注的研究显示，二者联合对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，可以改善大鼠神经功能，减少梗死面积，降低脑组织中IL-1，TNF-α的含量，其机制可能与其抑制了IL-1，TNF-α的表达有关。

［1］MELLADO TP,COURTLJ,GODOY FJ,et al.Cerebrovas-cular disease in a Neurologic Intermediate Care Unit in Chile.Analysis of 459 consecutive patients[J].Rev Med Chil,2005,133:1274-1284.

［2］TRAYSTMANRJ.Animal models offocal and global cerebral ischemia[J].ILAR J,2003,44(2):85-95.

［3］姜炎，田志强，牛延良.依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注后IL-1表达的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2009,12（15）：16-18.

［4］王春艳.奥扎格雷钠联合依达拉奉治疗急性脑梗死疗效评价[J].中国误诊学杂志，2010,1（22）：5357-5358.

［5］NAKAGOMI T,YAMAKAWA K,SASAKI T,at al.Effect of edaravone on cerebral vasospasm following esperimental subarachnoid hemorrhage[J].J Stroke Cerebrovasc Dis，2003，12 （1）：17.

［6］段云，李宝英，周瑞新，等.依达拉奉注射液治疗急性脑梗死60例疗效观察[J].中国实用神经杂志，2006，9（5）：77.