外周血中基质金属蛋白酶及其抑制物与反复流产的关系

谢立敏，徐 海，于文晶，周 岚，伊心浩，张建海，于云英，安 娜

(胜利油田中心医院，山东东营257034)

基质金属蛋白酶(MMPs)是参与细胞外基质降解和重塑正常组织的重要酶类，正常情况下MMPs和其组织抑制物(TIMPs)维持着一个动态平衡，该平衡对妊娠建立极为关键。本研究通过测定反复自然流产患者外周血及蜕膜中MMP-9/TIMP-1的表达，探讨不明原因反复流产患者的病因及发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年10月～2010年12月在胜利油田中心医院妇产科就诊的反复流产患者30例(试验组)，年龄26～38岁。随机选择同期行人工流产的正常健康早孕妇女30例(对照组)，年龄25～36岁;妊娠周数均≤8周，无慢性高血压、肝肾及血液系统疾病及急性炎症。两组年龄、健康状况均无统计学差异(P＞0.05)。

1.2 方法 人血浆MMP-9和TIMP-1酶联免疫吸附试剂盒均为美国R＆B SYSTEMS公司产品，深圳晶美生物工程公司提供，实验操作按照说明书进行;链霉菌抗生物素—过氧化酶试剂盒购自福州迈新公司。试验组及对照组均于流产前1 d采集肘静脉血4 ml，肝素抗凝，30 min内2～8℃常温下1 000 r/min离心 15 min，取部分上清测 TIMP-1。余液10 000 r/min再次离心10 min，取上清测 MMP-9。所有标本置于-20°保存备用。①外周血中MMP-9及TIMP-1检测:用标准稀释液分别梯度稀释标准品;在抗MMP-9及抗TIMP-1预包被板上分别加入标准品稀释液100μl至空白孔和零孔，待测标本和不同浓度的标准品各100μl至相应孔中，37℃孵育1 h;加入生物素标记的二抗100μl，37℃孵育2 h;加入已稀释的酶结合物100μl，37℃孵育30 min;再加入底物50μl，避光，37℃孵育15 min，每孔加入终止液50μl，450 nm波长下比色。②绒毛及蜕膜组织MMP-9及TIMP-1检测:所得绒毛及蜕膜组织用生理盐水冲洗后，立即放入4%多聚甲醛液中固定，常规脱水，石蜡包埋，统一切片、HE染色、免疫组织化学染色。

1.3 结果判断 ①外周血中MMP-9及TIMP-1结果判定:以吸光度为纵坐标，MMP-9及TIMP-1含量为横坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线求出待测样品中MMP-9及TIMP-1含量，两组间进行比较。②绒毛及蜕膜组织MMP-9及TIMP-1结果判定:采用4级半定量积分法进行结果判定。

1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，两组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血MMP-9及TIMP-1水平 试验组外周血MMP-9水平明显高于正常对照组(P均＜0.05)，而 TIMP-1 无统计学差异(P 均 ＞0.05)，试验组MMP-9/TIMP-1明显高于对照组(P＜0.05)，见表1。

表1 两组外周血MMP-9及TIMP-1水平比较(±s)

表1 两组外周血MMP-9及TIMP-1水平比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

MMP-9/TIMP-1试验组 30 3.30 ±3.56* 0.82 ±0.21 5.31 ±1.78组别 n MMP-9(ng/ml)TIMP-1(ng/ml)*对照组30 2.21 ±1.26 0.93 ±2.76 2.38 ±4.51

2.2 两组蜕膜组织中MMP-9及TIMP-1水平 试验组蜕膜中MMP-9水平明显高于对照组(P均＜0.05)，而 TIMP-1 无统计学差异(P 均 ＞0.05)，试验组MMP-9/TIMP-1明显高于对照组(P＜0.05)，见表2。

表2 两组蜕膜组织中MMP-9及TIMP-1水平比较( ± s)

表2 两组蜕膜组织中MMP-9及TIMP-1水平比较( ± s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

MMP-9/TIMP-1试验组 30 169±32* 94±23 1.6±0.5组别 n MMP-9(pmol/L)TIMP-1(pmol/L)*对照组30 101 ±21 93 ±36 1.0 ±0.3

3 讨论

胚胎植入是妊娠的关键环节。首先，子宫内膜蜕膜化是胚胎成功植入的先决条件，在早孕期抑制MMPs会限制基质细胞蜕膜化［1］。其次，滋养细胞的侵袭能力对于早期胚胎植入及胎盘形成至关重要。MMPs对ECM的降解是滋养细胞侵袭的限速步骤［2］。这一方面与随着妊娠的进展MMPs产生减少，滋养细胞的侵袭能力下降有关;另一方面，MMPs的特异性抑制剂TIMPs也能降低滋养细胞的侵袭能力［3］。胚胎滋养层和蜕膜同时合成的 MMPs和TIMPs之间的相互调控和平衡是维持正常妊娠的重要条件。

Iwashashi等［4］比较了自然流产和正常分娩孕妇的蜕膜组织中的胶原含量，发现自然流产者Ⅳ型、Ⅴ型胶原的含量较正常分娩者明显减少。由于Ⅳ型、Ⅴ型胶原是MMP-9的底物，故提示MMP-9有可能水解Ⅳ型、Ⅴ型胶原，使蜕膜组织坏死脱落，进而促发流产。孕激素通过MMPs介导作用在该过程中起重要作用［5］，若该作用异常，则可导致流产。如果滋养细胞侵蚀不足，则螺旋动脉尚可保留其收缩功能，使过多的血液流向绒毛间隙，对发育中的胚胎和胎盘增加压力，这可能是导致自然流产的原因。本研究中反复流产患者绒毛组织中MMP-9/TIMP-1明显偏移，且与外周血液MMP-9/TIMP-1变化一致，说明其在反复流产的发病过程中发挥重要作用。但TIMP1含量无统计学差异，其具体原因需进一步研究。

总之，成功的着床需要MMPs/TIMPs的平衡表达。多次着床失败患者可能存在MMPs和TIMP的表达异常，这为反复流产的研究提供了新的思路。

［1］Strakova Z，Szmidt M，Srisuparp S，et al.Inhibition ofmatrixmetalloproteinases prevents the synthesis of insulin-like growth factor binding protein-1 during decidualization in the baboon［J］.Endocrinology，2003，144(12):5339-5346.

［2］Campbell S，Rowe J，Jackson CJ，et al.In vitromigration of cytotrophoblasts through a decidual endothelial monolayer:the role of matrixmetallo proteinases［J］.Placenta，2003，24(4):306-315.

［3］Isaka K，Usuda S，Ito H，et al.Expression and activity ofmatrix metalloproteinase 2 and 9 in human trophoblasts［J］.Placenta，2003，24(1):53-64.

［4］Iwashashi M，Nakano R.Decreased type V collagen expression of spontaneous abortion during early pregnancy［J］.J Clin Pathol，1998，51(1):44-46.

［5］Osteen KG，Bruner TK，Keller NR，et al.Progesterone-mediated endometrialmaturation limits matrix metalloproteinase(MMP)expression in an inflammatory-like environment:aregulatory system altered in endometriosis［J］.Ann NY Acad Sci，2002，955(3):37-47.