红曲霉菌株的诱变及其发酵条件研究

高国赋，魏宝阳，杨 瀚，孙继民

（1.湖南省农业信息与工程研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；3.湖南省土壤肥料研究所，湖南 长沙 410125）

红曲霉 （Monascus purpureusWent.）别名 红曲、红糟、红大米，是散囊菌目中的一属子囊菌曲霉科真菌，存在于树木、土壤和堆积物等处。菌落初为白色，老熟后变成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成红色。红曲色素是以红曲米（经红曲霉菌发酵的籼稻、粳稻、糯米等）为原料，利用现代的生物技术提取而成的天然着色剂。红曲色素对pH、温度、金属离子氧化还原剂等较其他天然色素稳定，是一种优良的食品天然色素。在食品天然色素中，红曲色素一直是国内外学者研究的焦点。有学者对其进行毒性试验证明：红曲色素安全无毒。红曲色素应用于酒、糖果、熟肉制品、糕点等食品的着色，也可用于医药和化妆品的着色。目前，由于我国红曲色素发酵生产设备、色素后期提取及精炼工艺比较落后，菌种产色的水平较低，色素生产成本较高，限制了红曲色素在生产中的应用。通过菌种诱变选育提高生产菌株的发酵水平，降低生产成本，对我国食用色素产业的提升有着重要的意义。笔者采用紫外线和亚硝酸对红曲霉进行诱变，获得突变株，并对其发酵条件进行研究，以期为红曲色素的生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料为红曲霉（湖南农业大学生物科技学院生物工程系保存）；仪器有灭菌锅（TOMY SS-325）、紫外可见分光光度计（VIS-9100）等。

1.2 试验方法

1.2.1 红曲霉紫外诱变处理 紫外灯照射时间分别为：30、60、90、120、150、180、210 s；将盛有孢子悬液的平皿置于震荡器上充分振荡，紫外灯下照射30 s后，接种于3个平板，暗处培养，操作完成后再次紫外线处理30 s，按此操作直到完成7个梯度的照射，30℃暗培养，3 d后观察，选取比出发菌株菌落大、颜色深的菌落。

1.2.2 红曲霉化学诱变处理 制备亚硝酸浓度为0.01、0.02、0.04、0.08 mol/L 的诱变固体平板培养基。每平板涂布接种孢子悬液，30℃培养，2 d后观察生长情况，选择比出发菌株菌落大、颜色深的菌落，接种至不含亚硝酸的PDA斜面培养基上培养。

1.2.3 诱变菌株发酵能力测定 接种诱变株孢子悬液1 mL至发酵培养基，于30℃、130 r/min培养7～8 d，取菌液，4 000 r/min 离心 15 min，用 75%乙醇作为空白对照测定波长410 nm（黄色素）和510 nm（红色素）处的OD值。

1.2.4 色价测定 胞外色素色价测定：在没有标准品的情况下，参照国内外文献，采用测定色素的色价来表示色素含量，色价（μ/mL）=测得的OD值×稀释倍数，取2 mL发酵液过滤，以体积分数75%乙醇做空白对照，分别在410 nm、510 nm处测定胞外红黄色素和红色素。

菌体色素色价测定：称取菌体0.05 g，用70%乙醇溶解，定容至100 mL，振摇30 min后静置，取1.0 mL溶液，加70%乙醇溶液9 mL，用70%乙醇溶液作空白对照，在510 nm处测吸光度，按公式计算成品色价（μ/g）。

成品色价（μ/g）=OD510×1 000/样品质量

1.2.5 发酵条件的研究 发酵条件的影响因素选取按正交表L16（45）（见表1）的设计进行液体培养。

表1 发酵条件研究的L16（45）正交表

（1）发酵条件与产色水平研究：菌液10 mL，4 000 r/min离心15 min，取上清液，以75%的乙醇作为空白对照，分别在510 nm测定红色素和410 nm处测定黄色素，按公式计算总色价。

总色价=测得（OD410+OD510）×稀释倍数。

（2）菌体量与发酵条件间关系的研究：菌液过滤，滤渣用蒸馏水反复冲洗至滤液无色透明，称取菌体的湿重。同时每样品挑取0.05 g菌体备用，余下菌体烘干后称重。

（3）胞内色素与胞外色素含量分析：取16只试管，每支加入75%的乙醇10 mL，取步骤（2）中的0.05 g菌体，30℃萃取24 h后，4 000 r/min离心15 min，取上清液在410 nm和510 nm处测定OD值并记录，按公式计算每g湿菌体色价。

每克湿菌体色价=A值×100×稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 优良菌株的筛选结果

经过紫外诱变和化学诱变后，分别筛选出了一株比出发菌株生长快、菌落大、颜色深的优良菌株，编为5-2和1-1-3，对应的照射剂量和诱变剂量为150 s和0.04 mol/L，在对比试验中，5-2和1-1-3的发酵色价分别为7.09 U/mL和12.32 U/mL，并且1-1-3的生长速度大大优于5-2（见图1）。因此最终筛选出1-1-3为最佳菌株，在同时接种的4只斜面试管中，1-1-3生长最为密集，菌落厚约2 mm，2.5 d后有大量菌丝长出，相比之下，5-2号菌落稀疏、2.5 d观察时并未长出菌丝；因此确定1-1-3为最佳诱变菌株。

图1 紫外诱变与化学诱变菌株对比

2.2 正交试验结果

2.2.1 不同因素对产色量的影响 从表2和表3可以看出，各条件下色素产量有差异，色素产量最低的是2号和8号，没有菌体生长，色素产量最高的是10号，其对应的发酵条件为：转速160 r/min，pH为6，温度为32℃，麦芽糖和牛肉膏。

从表2中可以看出，对胞外色素产量影响由大到小依次为：温度>氮源>碳源>pH值>转速，最适培养条件：转速为 160 r/min，pH 值为 6，32℃，麦芽糖和牛肉膏；不同的温度对胞外色素产量影响最大，最适宜温度为32℃，不同氮源胞外色素产量差异较大，无机氮培养均在比较低的水平。

从表2中还可以看出，对胞内色素产量影响由大到小依次为：氮源>pH值>碳源>温度>转速，最适培养条件:转速为130 r/min，pH值为5，26℃，麦芽糖和硝酸钠。培养环境偏酸性，产色量与温度成反比，与胞外色素情况相反，胞内色素对硝酸钠的吸收较好。

2.2.2 不同因素对菌体生长的影响 各因素对干重与湿重的影响效果大致相同，按影响的重要性从大到小依次为：温度>碳源>氮源>转速>pH值。

2.2.3 红色素与黄色素产量间的关系 从表3中可以看出，在细胞外部，黄色素产量普遍大于红色素，单个常量最多是黄色素；总色素的产量以1号、7号、10号为多，所有条件中红、黄色素产量差异较大的也是前述3瓶，可见产量越大，两种色素产量差异越大，但不超过20%。在细胞内部，色素产量总体偏低，黄色素产量普遍大于红色素，与胞外色素一样，色素总产量越大，红黄色素产色量的差异越大。红色素产量的最佳发酵条件与菌丝生长除pH值因素以外基本相同，偏中性有利于红色素的合成，最佳条件也与胞外色素的最佳条件一致，说明胞外色素在色素总产量中占主要部分。研究结果表明，黄色素的最佳发酵条件为：转速160 r/min，pH值为5，温度32℃，麦芽糖和牛肉膏，与红色素基本相同。

表2 正交试验结果

表3 各条件下胞内外色素含量与干湿重

3 讨论

通过紫外诱变和以亚硝酸为诱变剂的化学诱变，得到了一株生长速度快、颜色深、稳定性好的突变株1-1-3号。紫外诱变和化学诱变这两种传统方法仍然是育种的有效手段，操作简便、成本低、效果好，但是也存在缺点：工作量极大、定向诱变难度大，诱变剂量过大易引起负突变株比例增加，而且化学诱变试剂对环境和人体都有一定危害，如果能在代谢水平和基因水平上有所突破，那么传统诱变方法有望退出人们的视线。

在发酵条件的研究中发现，红曲霉所产的色素大部分分泌到胞外，产胞外色素最佳条件为：转速160 r/min，pH 值为 6，32℃，麦芽糖和牛肉膏；产胞内色素最佳条件为：转速 130 r/min，pH值为5，26℃，麦芽糖和硝酸钠；菌体生长最佳条件为：转速160 r/min，pH值为6，32℃，葡萄糖和牛肉膏。

红色素和黄色素波长的最大吸收峰分别为510 nm和410 nm。从研究结果来看，胞内和胞外的两种色素产量差异幅度较小，基本成正比，总色价较大的摇瓶中两色素色价相差的绝对值比总色价小的要大，可能是因为红色素和黄色素在代谢途径上游有相同的前体物质，而在代谢途径下游的酶活性差异较大，相同的前提物质合成量越大，最终产物—色素的产量差异也就越大。红曲色素产量与氮源的种类密切相关，有机氮的利用优于无机氮；试验还发现，酸性条件下有利于黄色素的合成，在生产发酵中如需增加红色素的产量，可以通过调节发酵液的pH值偏中性来达到增产的目的；胞外色素产量的最佳调价为pH=6，有研究认为，偏酸时，H+可以与红曲霉中的营养物质结合，从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离子，使红曲霉产生较多的色素；而当pH偏碱时，水合氢离子和OH-能降低营养物质的溶解度和细胞表面的电荷，从而降低产色。

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