高效液相色谱法测定血液透析液中枸橼酸根的含量*

李 沅，姜 熙，樊 铂，崔 红，李 波

(1.天津市医疗器械质量监督检验中心，天津 300191； 2.天津市肾友达医疗设备技术开发有限公司，天津 300384)

血液透析作为慢性肾衰竭患者的重要肾脏替代治疗手段，临床应用已有40余年的历史。通过血液透析，可以改善肾功能衰竭、尿毒症患者体内积累的高毒素状态。但由于血液透析是一项特殊的治疗技术,应加强血液透析治疗质量的规范化管理,保证血液透析治疗质量。

我国于2006年6月正式实施了医药行业标准YY 0598-2006《血液透析及相关治疗用浓缩物》，该行业标准对最终透析液的溶质浓度提出了严格的要求，并提供了相应的试验方法。通过在配方中加入有机酸的方式调节最终透析液的pH值。过去常用的有机酸主要为醋酸，随着透析技术的发展，近年来越来越多的企业选择固态的枸橼酸替代液态的醋酸来调节pH值，方便运输的同时还能解决高危出血病人血液透析中的抗凝难题，起到局部抗凝的作用[1]。然而目前的行业标准YY 0598-2006仅适用于醋酸型碳酸氢盐透析液，并不适用于枸橼酸型碳酸氢盐透析液，加之国内目前一直缺乏对枸橼酸根离子特异性较高的定量测试方法，这就给该类产品的质量控制和市场监管带来了许多实际困难。本试验采用了高效液相色谱法测定枸橼酸根的含量，区别于以往酸碱滴定、分光光度法测定枸橼酸根的方法，达到定性定量测定的要求。结果表明，此方法简便、准确，测量结果满意，有一定的行业推广价值。

1 仪器与试药

1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦)，UV紫外检测器，G1316A型色谱工作站。枸橼酸三钠·2H2O对照品(天津市福晨化学试剂厂，批号20100822)。血液透析干粉(批号为10071504由天津市挚信鸿达医疗器械开发有限公司提供，批号为1008601、1008602、1008603由天津市肾友达医疗设备技术开发有限公司提供)。硫酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：phenomenex Rezex ROA-Organic Acid(300 mm×7.8 mm,8 μm)；流动相：0.002 5 mol/L硫酸溶液；柱温：室温；检测波长：220 nm；流速：0.6 ml/min；进样量：20 μl。

2.2溶液配制

2.2.1供试品溶液 按使用说明书的要求将A、B透析粉分别溶解成A、B浓缩液，并按照使用说明书规定的稀释比例将A浓缩液、B浓缩液和透析用水混合并摇匀，成为最终透析液。精密量取最终透析液1 ml置10 ml量瓶中，加透析用水稀释至刻度，取适量经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2对照品溶液 精密称取枸橼酸三钠对照品139.4 mg，用透析用水定容至1 000 ml量瓶，做为标准储备液。用移液管精密量取10、15、20、25和30 ml储备液至100 ml量瓶，并用透析用水稀释至刻度，摇匀，制得4.74×10-2、7.11×10-2、9.48×10-2、11.85×10-2和14.22×10-2mmol /L对照品溶液。

2.2.3空白溶液 透析用水作为空白溶液。

2.3方法适用性试验 依给定的色谱条件，分别取供试品溶液、对照品溶液和空白溶液各20 μl，进样，记录色谱图，见图1。枸橼酸根的保留时间约为9 min,与其他组分峰的分离度>1.5，理论塔板数为5 466。

1.枸橼酸根

2.4线性关系 分别取 “2.2.2”项下方法配制的对照品溶液，按给定的色谱条件进行测定，记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积(Y)对溶液浓度(X)求得回归方程为Y=288.955 95X-0.583 503(r=0.998 80)，在4.74×10-2～14.22×10-2mmol /L范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5精密度试验 取浓度为9.48×10-2mmol /L的对照品溶液连续进样5次，RSD为0.67%，表明所选定的色谱条件系统稳定。

2.6重现性试验 取同一批样品(批号1008603)按“2.2.1”项下方法配制供试品溶液，连续进样5次，平均含量为标示含量的98.6%，RSD为0.79%(n=5),表明方法重现性好。

2.7稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按给定的色谱条件在0、2、4、6和8 h分别进样测定峰面积，RSD为1.2%，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.8回收率试验 取6份已知含量的样品，分成3组，每组分别加入对照品溶液(14.22×10-2mmol /L)14.35、16.74和19.13 ml，测定峰面积，计算回收率，结果见表1。测得平均回收率为102.52%，RSD为1.31%(n=6)。

2.9样品含量测定 取批号10071504(标示含量1.01 mmol /L)、批号1008601(标示含量0.88 mmol/L)、批号1008602(标示含量1.03 mmol /L)、批号1008603(标示含量1.02 mmol /L)样品各1份，分别按供试品溶液的制备方法，制备待测溶液。取20 μl对照品溶液、空白溶液和供试品溶液进样。分别进样3次，测定峰面积，计算含量，结果见表2。

表1 加样回收试验结果(n=6)

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1针对枸橼酸三钠的不稳定性及其对照品浓度较低，不宜储存过久的特点，故建议使用对照品时最好当日配制，尽量在8 h内使用。

3.2在样品处理过程中，要严格按照使用说明书配制最终透析液，供试品做稀释10倍处理。这主要是考虑到最终透析液中除含有少量枸橼酸根离子外，还含有大量的钠离子、氯离子及碳酸氢根离子等，这些离子的含量都要远大于枸橼酸根的含量，在使用离子排阻色谱柱进行分离时，这些干扰物都会因含量较高而严重影响色谱峰的判定。因此对供试品作适当比例的稀释，既能确保枸橼酸根的准确检出，又能有效避免其他干扰物对主峰的干扰。

3.3本试验待测组分主要有两个色谱峰，分别是干扰峰和枸橼酸根色谱峰，通过与对照品的对比，可以确定枸橼酸根的出峰时间约为9 min。

3.4通过对枸橼酸含量的测定表明，该方法操作简单，重现性好，结果稳定。由于透析液中枸橼酸根含量测定方法国内未见相关报道，故此研究为保证该产品的质量提供了参考。

1 桂保松,吕星，高卫华，等.新型枸橼酸盐浓缩抗凝血液透析液的实验研究. 中国血液净化,2002,1(3):36