HPLC法测定金匮肾气丸中马钱苷含量*

赵 刚，韦 辉，吴贵华

(1.天津市武清区药品检验所，天津 301700； 2.天津中医药大学，天津 300193； 3.天津市药品检验所，天津 300070)

金匮肾气丸是由地黄、山药、山茱萸(酒炙)等共10味药材组成的大蜜丸,具有温补肾阳，行气行水之功效。处方中山茱萸(酒炙)可补益肝肾，马钱苷是山茱萸主要有效成分之一。采用HPLC法测定金匮肾气丸中马钱苷含量可用作金匮肾气丸质量控制，并可对生产中使用的山茱萸(酒炙)药材质量提供客观评价。

1 仪器与试药

日本SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，LC solution工作站。马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号111640-200503)，金匮肾气丸(天津市某药品生产企业生产，批号144447、144448、144449)。四氢呋喃、乙腈、甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(化学纯，天津市化学试剂厂)，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax Sb- C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以四氢呋喃-甲醇-乙腈-水(1∶7∶4∶88)为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行洗脱。检测波长为236 nm，柱温35 ℃ ，流速1 ml/min。理论板数按马钱苷峰计算应不低于5 000。

表1 马钱苷梯度洗脱系统

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备 取马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含15 μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取“重量差异”项下的样品，剪碎，取约1.5 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，摇匀，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备 按处方取除酒茱萸的各味药材，按制备工艺制得丸剂样品，再按“2.2.2”供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。

2.3阴性对照试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件分析。结果阴性样品在马钱苷色谱峰对应的保留时间无干扰。见图1。

2.4线性关系考查 取马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.006 216、0.010 36、0.020 72、0.031 08、0.051 80和0.103 6 mg的溶液，作为对照品溶液，分别精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下的色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：Y=1.601 821 19×106X-5.789 397 8×103(r=0.999 99)。结果表明马钱苷在0.062 16～1.036 00 μg范围内线性良好。

2.5进样精密度试验 取批号为144447的样品1份，按 “2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测得样品中马钱苷峰面积值分别为179 093、177 644、179 383、180 013、172 941、179 212，峰面积平均值为178 048；峰面积的RSD为1.47%。

2.6重复性试验 取批号为144447的样品，共6份，按 “2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，测定每份样品中马钱苷含量。分别为0.187 0、0.185 1、0.189 0、0.186 5、0.187 6、0.188 2 mg/g。马钱苷平均含量为0.187 2 mg/g，RSD为0.7%，表明本方法重复性良好。

1. 马钱苷

2.7稳定性试验 取批号为144447的样品1份，按 “2.2.2.”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、3、6、9、12、15 h，测定样品中马钱苷峰面积。峰面积值分别为 179 093、180 013、177 417、180 069、178 751、178 936。测得峰面积平均值为179 047， RSD为0.5%， 表明供试品溶液最少在15 h内稳定。

2.8回收率试验 取批号为144447的样品，剪碎，取约0.75 g，共6份，精密称定，分别精密加入马钱苷对照品甲醇溶液(0.031 08 mg/ml)5 ml，精密加入甲醇20 ml，再按照“2.2.2”供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率，结果平均回收率为101.9%，RSD为1.77%。见表2。

2.9样品含量测定 取3个批号(144447、144448、144449)的样品，按照“2.2.2”项下制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，测定样品中马钱苷含量。结果分别为0.186 1、0.196 0、0.186 5 mg/g(n=2)。

表2 加样回收试验测定结果

3 讨论

3.1流动相的选择 参考相关文献[1]并结合本品的特点，对乙腈-水(15∶85)、(10∶90)、(9∶91)，乙睛-0.05%磷酸(9∶91)、(11∶89)，四氢呋喃-甲醇-乙腈-水(1∶7∶4∶88)、(1∶4∶4∶91)等进行选择。因本品含各类色谱杂质峰较多，马钱苷色谱峰出峰时间太早，不能达到基线分离，并有小杂质峰的干扰，对测定结果有影响，选择马钱苷色谱峰保留时间在30 min左右时，分离效果最好。结果选择四氢呋喃-甲醇-乙腈-水(1∶7∶4∶88)作为本方法的流动相。因在80 min后仍有较多色谱峰出现，采用梯度洗脱的办法，可去除其他色谱峰的影响，缩短分析时间，马钱苷色谱峰可达到基线分离，分离度符合要求。

3.2提取方法的选择

3.2.1提取溶剂 取批号为144447的样品，剪碎，取约1.5 g，精密称定，分别用甲醇、70%甲醇、50%甲醇25 ml作为溶剂，加热回流60 min，分别测定样品中马钱苷含量。不同溶剂提取的含量测定结果平均值为0.185 2 mg/g，其RSD为0.91%，无显著差别。用甲醇提取的结果含量最高，试验操作便利，故本试验方法采用甲醇为提取溶剂。

3.2.2提取方式 取批号为144447的样品，剪碎，取约1.5 g，精密称定，分别精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理或加热回流60 min，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，测定样品中马钱苷含量分别为0.180 4、0.186 1 mg/g(n=2)。4份测定结果RSD为2.1%，说明采用超声处理和加热回流两种提取方式，测定结果基本相同，加热回流提取测定结果较高，故选择加热回流为样品的提取方式。

3.2.3提取时间 取批号为144447的样品，剪碎，取约1.5 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称定重量，分别加热回流40、60、120和160 min，放冷，再称定各自重量，用甲醇补足减失各自的重量，滤过，取续滤液，测定样品中马钱苷的含量。分别为0.186 2、0.186 1、0.191 2、0.188 8 mg/g(n=2)，RSD为1.3%。测定结果显示，提取时间为40～160 min，其含量测定结果无明显差异。本试验方法选定加热回流时间为120 min。

3.3耐用性试验 取批号为144447的样品，按 “2.2.2”项下方法制成供试品溶液，分别使用Agilent Zorbax Sb- C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱； Sepax Sappire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱和Diamonsil - C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，按“2.1”项下色谱条件，测定样品中马钱苷含量。结果显示，采用三种不同色谱柱测定的结果分别为0.186 1、0.190 2和0.183 9 mg/g，平均值为0.186 7 mg/g，RSD为1.71%，无明显差别，表明该含量测定方法耐受性良好，具有可行性。

1 中国药典.一部.2010：597-602