离体和在体大鼠心肌细胞凋亡模型的建立

姚玲玲，黄晓伟，朱依纯

(复旦大学上海医学院生理与病理生理学系，上海 200032)

心肌细胞凋亡是心脏缺血/再灌注(I/R)损伤中导致心脏结构和功能损伤的原因之一。例如，在慢性心肌缺血(尚未达到心肌梗死的程度)区域，或在急性心肌梗死的梗死区周边，甚至在急性心肌梗死早期的梗死区，常伴有程度不等的心肌细胞凋亡［1－2］。寻求能够抗心肌细胞凋亡的药物和干预手段成为心血管临床和基础研究的一个主要领域。因此，本研究拟通过离体和在体心肌细胞凋亡模型的建立，对其基本特征进行评价，为心肌梗死机制的研究以及保护心肌药物的筛选提供合适的离体和在体模型。

1 材料与方法

1.1动物Sprague-Dawieg(SD)大鼠，出生1～2 d;♂ WKY大鼠8只，体质量140～160 g，均购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2主要试剂及仪器细胞培养基(DMEM/F12)购自Sigma公司;0.1%胰蛋白酶和胎牛血清购自Gibco公司;TUNEL试剂盒购自Roche公司。DHX-150小动物呼吸机购自成都仪器厂。

1.3模型的建立离体细胞凋亡模型:1～2 d的SD大鼠15～20只，消毒皮肤后剪开胸廓，取下心脏，剪成1 mm3的碎块，0.1%胰酶37℃水浴中预消化10 min，自然沉淀弃上清，重复1次;加入10～15 ml 0.1%胰酶，37℃水浴搅拌15 min后取上清，5%特级小牛血清终止消化，1 500 r·min－1离心3 min后弃上清得细胞沉淀，2 ml完全培养液(DF12，10%小牛血清)使细胞重悬，重复这一消化步骤3～4次，收集所有的细胞悬液，混匀置于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h，小心吸出未贴壁细胞，调整细胞密度至5×108个·L－1接种培养。心肌细胞培养24 h后用无糖无血清的DMEM/F12培养液继续培养24 h后，培养基换成Hank's平衡液后，将细胞放在37℃、95%氮气－5%CO2的环境中30 min，再重新放入37℃、5%CO2培养箱中培养2 h。

在体心肌梗死细胞凋亡模型:大鼠称重后腹腔注射6%水合氯醛溶液5×10－3L·g－1，麻醉，仰卧固定，气管插管，连呼吸机，备皮，以心尖搏动最强的点为中心，作一横行切口，长度3～5 cm，显露肋骨，由第4肋间入胸暴露心脏，从左心耳下方2～3 mm入针，缝扎，在结扎的时候放入一小段PE管，以备再灌注的时候用。结扎30 min后，将小PE管取出，进行再灌注2 h。

1.4观察的指标及检测方法

1.4.1TUNEL法测原代培养细胞凋亡情况将种有细胞的盖玻片放在固定液中室温固定20 min，通透液中(0.2%TitonX-100，3%枸橼酸钠的PBS溶液)冰上通透2 min，每片加50 μl TUNEL反应液湿盒中37℃ 60 min避光孵育，PBS中洗3次，每次5 min。荧光显微镜下观察，激发波长488 nm，接受波长530 nm。

1.4.2TUNEL法测梗死心肌周边区凋亡细胞直接将心脏取出，PBS中洗去血液，放入4%多聚甲醛中过夜，30%蔗糖中脱水至心脏下沉，进行冰冻切片，TUNEL染色，观察拍照。

1.4.3凋亡细胞DNA的检测细胞用PBS洗3次，胰酶消化，离心，取沉淀，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，溶解于30 μl TE中。琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min后凝胶成像系统下观察并拍照。

1.5统计学方法用SPSS17.0统计软件分析数据。实验结果均以±s表示，两组间比较用独立样本t检验。

2 结果

2.1原代培养大鼠心肌细胞凋亡缺氧30 min复氧2 h引起原代培养大鼠心肌细胞凋亡，TUNEL染色呈现大量阳性细胞(Fig 1，Fig 2)。

Fig 1 Hypoxia/rexygen-induced cardiomyocyte apoptosis measured with TUNEL staining

Fig 2 Hypoxia/reoxygen-induced cardiomyocyte apoptosis

2.2 DNA ladder检测DNA凝胶电泳结果显示凋亡诱导组细胞呈现明显的带状条纹，经检测后为180 bp的倍数，而对照组只有一条大分子量的DNA条带。见Fig 3。

Fig 3 Hypoxia/reoxygen-induced cardiomyocyte DNA ladder production

2.3心梗模型造成的大鼠心肌细胞凋亡心脏缺血30 min，再灌注2 h后进行心脏冰冻切片的TUNEL染色看到大量凋亡细胞(见Fig 4)。

Fig 4 Ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte apoptosis in the area of risk in vivo

3 讨论

心肌梗死是严重危害人类健康的疾病，利用溶栓疗法、血管重建等方法的应用，可使缺血心肌恢复血流再灌注。但是缺血心肌功能未必恢复，有时反而损伤加重，心肌细胞凋亡在缺血/再灌注损伤中的作用长期以来受到关注，如何保护心肌细胞，减少凋亡细胞的数量，减小梗死周边危险区(area of risk)成为心血管领域研究的热点。体外培养时诱导心肌细胞凋亡的方法主要有药物诱导和物理诱导两种。药物诱导有应用代谢抑制的药如2-deoxy-D-glucose［3］或Fas凋亡通路激活药物actinomycin D［4］，或者应用离子通道阻断剂，如氯离子通道阻断剂staurosporine诱导心肌细胞凋亡［5］等;而物理诱导主要有缺氧和营养剥夺两种，临床上心肌梗死发生时，心肌细胞同时受到缺氧和营养剥夺两种伤害，而这两种刺激因素对心肌细胞的损害不完全相同，我们采用的缺氧/复氧处理法就是一种综合营养剥夺和缺氧刺激的方法，这种处理能够快速造成心肌细胞凋亡，有利于我们观察到药物对心肌细胞凋亡的干预作用，譬如可以在细胞进行缺氧处理前给予药物预处理一段时间，再进行缺氧/复氧损伤，观察药物的作用。

大鼠冠状动脉左前降支结扎造成心肌梗死的模型现在已经被广泛采用［6－7］。这是一种急性梗死的模型，相对于用动脉环造成的慢性心肌缺血模型，其动物来源方便(慢性心肌缺血模型多在小型猪身上制作)，操作便捷，造价低廉，可重复性强，缺血30 min，再灌注2 h后，在梗死灶周边区有大量凋亡细胞的存在，如何保护这些凋亡细胞，逆转其凋亡的通路，恢复其功能是值得探索的很有价值和意义的课题。

综上所述，原代心肌细胞缺氧/复氧损伤引发的凋亡模型和在体大鼠缺血/再灌注损伤引发的细胞凋亡模型具有操作简单、成功率高等特点，可以用于心肌梗死机制的研究以及保护心肌药物的筛选。

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