人类胚胎干细胞分化研究

刘 超，刘丽华，方圣云

(安徽医科大学1.基础医学院组胚教研室，2.临床药理研究所，安徽合肥 230032;3.马里兰大学生物医学工程和技术中心，Baltimore，MD 21201 USA)

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)具有自我更新(self-renewal)和多能性(pluripotent)的特点。人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell，HESC)研究既有助于对人类疾病和发育生物学的理解，也在再生医学和新药研发和评价中有着广泛的应用前景［1－2］。HESC分化成人体任何一种细胞的能力为人类发育研究和重大疾病替代治疗提供了取之不尽的细胞来源。首先，来源于HESC的神经祖细胞为人类神经形成研究，中枢神经系统发育研究和帕金森病以及脊髓损伤等疾病的细胞替代治疗带来巨大希望。但是目前常用的HESC神经系分化方法仍然存在较多不足，例如形成 embryoid bodies(EBs)中间体的方法存在非神经细胞系的污染，限制了神经系分化的效率和特异性;使用基质细胞(PA6或MS5)共培养方法和使用Matrigel，存在动物类材料和病原体的污染［3］。因此，发展可控条件下的无EB中间体形成、无滋养层细胞、无动物成分的高效HESC培养和神经分化方法成为再生医学研究中亟待解决的问题。其次，HESC的分化特性，使其成为一种发育研究的细胞来源，为发育生物学研究提供良好的研究平台。为此，我们在无滋养层细胞培养基础上，建立一种使用无动物成分细胞基质和化学成分已知培养液诱导HESC神经系分化方法;我们还研究视黄酸诱导H9细胞分化过程中内质网应激相关蛋白BIP表达的变化，探索H9细胞分化在发育研究中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1H9细胞HESC，H9 细胞系(P23 ～)，购自美国国家干细胞银行(WiCell，Madison，WI)。

1.1.2试剂mTeSRTM1购自加拿大 Stem Cell公司。Matrigel购自美国BD Bioscience公司。视黄酸(All-trans retinoic acid，RA)、二甲亚砜(DMSO)、human insulin、progesterone、putrescin、human fibronectin、sodium selenite、human holotransferrin、recombinant人Ⅳ型胶原、polyornithine和human laminin购自美国Sigma公司。Pierce ECL免疫印记化学发光试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。bFGF购自美国Cell Signaling公司。B27 supplement购自美国Invitrogen公司。Human Vitronectin购自美国 Promega公司。DMEM:F-12购自美国Cellgro公司。

1.1.3抗体anti-Oct4和 anti-BIP抗体购自 Cell Signaling，anti-β-actin抗体购自 Sigma，anti-Map2 和anti-Tuj1抗体购自Chemicon。

1.2 方法

1.2.1H9细胞培养参考公司手册和文献方法［4］，H9细胞培养在Matrigel包被的培养板内，给以mTeSRTM1培养液。每天换液1次，细胞生长4～6 d后，除去分化的细胞，按1∶6的比例进行传代。1.2.2神经分化参考文献方法［5］，选择有穹顶样隆起结构的H9细胞群，行机械分离转移到人源基质(10 mg·cm－2Ⅳ型胶原、0.2 mg·cm－2vitronectin和5 mg·cm－2fibronectin)包被的培养皿内，给予mTeSRTM1培养液。1周后将形成的花样结构(rosette-like structure)转移到新包被的培养皿内或玻片上，给与神经分化培养液(DMEM:F-12，B27 supplement，25 g·L－1human insulin，6.3 mg·L－1progesterone，10 g·L－1putrescin，50 μg·L－1sodium selenite，50 g·L－1human holotransferrin 和8 μg·L－1human recombinant bFGF)。培养7 d后，将细胞转移到polyornithine和laminin包被的培养皿内或玻片上，用神经分化培养液继续培养4周或4周以上。

1.2.3视黄酸诱导分化用含有10 μmol·L－1RA的mTeSRTM1处理细胞，每天换液1次，持续5 d。d 6将H9细胞收获裂解，裂解液经免疫印记(immunoblot，IB)检测相关蛋白表达。

1.2.4免疫荧光检测分化和未分化的H9细胞用4% 多聚甲醛固定，1×PBS清洗6遍，室温下用含1%BSA和0.1%saponin的1×PBS封闭60 min，一抗同样用含1%BSA和0.1%saponin的1×PBS稀释，室温下和细胞孵育2 h后，用抗兔或抗鼠的Alexa Flour-488以及Alexa Flour-594抗体室温孵育2 h，或用结合有FITC的鸡荧光第二抗体孵育2 h。封片晾干后，置于 Zeiss Axiovert 200M倒置荧光显微镜下观察成像。

1.2.5免疫印记参考文献方法［6］，将细胞裂解获得裂解液，BCA法测定蛋白浓度。吸取等量样品上样，经SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)上。分离后的蛋白成分分别和相应抗体孵育后，用ECL免疫印记化学发光试剂盒检测。蛋白表达的定量用photoshop软件处理。

2 结果

2.1H9细胞的特征蛋白Oct4表达未分化的H9细胞在无滋养层细胞培养条件下生长良好，其核内表达特征性蛋白Oct4(Fig 1A，B)，分化后的细胞核内Oct4的表达基本消失(Fig 1C，D)。

2.2神经前体细胞分化H9细胞经神经分化培养液处理后，分化7 d的H9衍生细胞90%表达有神经前体细胞特征性蛋白Nestin(Fig 2A，D，arrows)，一定数量的细胞表达神经元特征蛋白Tuj1(Fig 2B，D，arrow heads)。

2.3神经细胞分化分化21 d的H9衍生细胞形成神经管样结构(Fig 3 A，C，arrows)，且该类结构周围存在大量Tuj1阳性细胞(Fig 3B，D)。提示神经管样结构的形成可能促进H9细胞神经分化。分化46 d的H9衍生细胞同时表达神经细胞特征蛋白Map2(Fig 3E)和Tuj1(Fig 3F)。

2.4RA诱导分化的H9细胞内BIP蛋白表达的变化H9细胞经RA处理5d，Oct4蛋白的表达随分化逐渐下调，5 d后其表达已几乎消失(Fig 4A);而BIP蛋白的表达随分化逐渐上调(Fig 4A，B)。提示BIP可能参与RA诱导的H9细胞分化。

Fig 1 Expression of Oct4 in H9 and H9 derived cells

Fig 2 Neural progenitor cells derived from H9 cells

3 讨论

ESC是高度未分化的细胞，具备体外无限增殖和诱导分化成三个胚层细胞的特性。HESC为再生医学提供了取之不尽的功能性细胞来源，为疾病研究提供新型的细胞模型的同时也为药物药效学和毒理学的研究提供了良好的平台［7－9］。

本研究采用人源基质和化学成分特定的神经分化培养液诱导神经分化。人源基质材料包括Ⅳ型胶原、vitronectin和 fibronectin。其中一定浓度的vitronectin及其衍生肽已经被最新文献报道可用于胚胎干细胞的长时间培养［10－11］。我们所用神经分化培养液的主要化学成分包括B27 supplement，N2 supplement(主要含 human insulin，progesterone，putrescin，sodium selenite，human holotransferrin)和bFGF。上述成分已经被广泛用于胚胎干细胞神经分化研究［3］。我们诱导分化的神经细胞经机械分离后可获得90%以上的Nestin阳性细胞，形成的神经管样结构富含Tuj1阳性神经元。这类衍生的神经细胞将是神经退行性疾病的细胞替代疗法的潜在细胞来源，还可以用作筛选神经系统疾病相关药物的平台。

BIP是一主要的内质网分子伴侣，参与内质网蛋白质量控制以及内质网膜信号活化的调控，参与多种生理和病理过程［12］。最近的研究发现［13］，纯合子BIP敲除导致小鼠死亡，伴随胚胎细胞分化能力显著降低和内细胞层严重凋亡，相对的杂合子小鼠则可以成活且其表型正常。在非洲爪蛙的早期发育中，不同时间和空间BIP mRNA的表达呈现不同方式;内质网应激则可以促进BIP mRNA在相应胚胎结构内的表达［14］。文献报道［15］，BIP 在胚胎发生过程中表达而且RA可以激活胚胎瘤细胞内的BIP启动子。此外，RA在胚胎发育中扮演重要角色［16］，同时也参与干细胞向神经前体细胞、造血母细胞和心肌细胞等功能性细胞的定向分化［17－20］。因此本研究采用含RA的mTeSRTM1诱导H9细胞分化，以探索HESC在发育研究中的潜在作用。我们发现随RA诱导分化BIP蛋白表达逐渐升高，一方面验证了RA对BIP的调节功能，一方面也提示BIP蛋白在发育过程中的潜在作用，为干细胞分化用于发育相关的基础研究提供了较明确的实验支持。

Fig 3 Neurons derived from H9 cells

Fig 4 Upregulation of BIP in differentiated H9 cells

综上所述，HESC的神经分化，使大规模的衍生神经细胞的获得成为可能，为相关神经疾病的研究和药物筛选研究提供潜在的细胞来源和平台。而RA诱导的HESC的分化，可为发育生物学研究提供较好的体外研究平台。

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