盐酸小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的动物实验

权 华，赵靖霞，徐 铮，姜远英

近年来真菌感染率急剧上升，致病性真菌种类增多，但白念珠菌（Candida albicans）仍然是临床最常见的致病性真菌，约占所有医院真菌感染的50%～60%[1，2]。系统性白念珠菌感染病死率高达38%，是引起癌症患者和艾滋病患者病死的主要原因。由于抗真菌药物有限，科研工作者在不断试图开发新型抗真菌药物，目前氟康唑仍然是临床上治疗白念珠菌感染的首选药物，这是由于它具有无可替代的优势：生物利用度高（>90%），组织分布广，不良反应少，深部真菌感染疗效好等。随着氟康唑长期、大量应用于真菌感染的预防及治疗，导致白念珠菌耐药性普遍产生，成为临床治疗失败的主要原因[3]。为解决以上问题，抗真菌药的联合应用已经成为临床抗真菌治疗的发展方向之一。在笔者前期的体外实验中，针对临床耐药白念珠菌0304103菌株的生长曲线实验显示盐酸小檗碱与氟康唑合用的抑菌作用具有小檗碱剂量依赖性，而且体外琼脂平板扩散实验、时间-杀菌曲线，以及对40株菌的棋盘式微量稀释实验充分证实了盐酸小檗碱与氟康唑合用对临床耐药白念珠菌的协同作用[4]。因此本研究主要针对临床耐药白念珠菌，从动物实验验证了盐酸小檗碱与氟康唑合用具有协同抗真菌作用，现总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 临床耐药白念珠菌编号0304103，由长海医院真菌室提供，并经形态学和生化学鉴定。

1.1.2 药物 氟康唑注射液（2 mg/ml）由上海信谊金朱药业有限公司生产，盐酸小檗碱由上海利生制药厂提供。氟康唑注射液、盐酸小檗碱分别以PBS稀释或溶解，配制用药。

1.1.3 动物 远交系ICR小鼠90只， 雌性，6～8周，18～22 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，清洁级（许可证号：SCXK9(沪)2003）。

1.1.4 仪器 HZQ-F160全温振荡培养箱 （江苏太仓市实验设备厂），Biofuge stratos高速冷冻离心机（Heraeus），Leica RM2135石蜡切片机 （德国 Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠系统性真菌感染模型的建立 从长海医院真菌室菌液中接种临床白念菌株0304103，在YEPD培养基中振荡培养过夜，使其达到指数生长期末期，再活化2次，以1%接种到新鲜的YEPD 培养基中，即10 mlYEPD中加100 μl菌液于100 ml锥形瓶中培养16 h，1000×g离心5 min，用0.9%生理盐水洗涤3次至上清液无色，去上清，以0.9%生理盐水调至菌液浓度为5×106CFU/ml。尾静脉注射真菌溶液0.1 ml/10 g造成ICR小鼠系统性真菌感染。

1.2.2 分组给药并观察存活时间 90只ICR小鼠随机分为6组，15只/组，分别为真菌感染模型组（空白对照组）、氟康唑（0.5 mg/kg）单用治疗组、盐酸小檗碱（9 mg/kg）单用治疗组、盐酸小檗碱（1 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治疗组（简称合用 1组）、盐酸小檗碱（3 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治疗组（简称合用2组）以及盐酸小檗碱（9 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治疗组（简称合用3组）。在小鼠系统性真菌感染模型建立2 h后，各给药组分别腹腔注射给药0.2 ml/10 g，模型组（空白对照组）腹腔注射溶剂PBS0.2 ml/10 g，1次/d，连续给药7 d。观察小鼠死亡情况，记录存活时间，计算每天各组存活百分率，共观察35 d后，将存活小鼠麻醉后处死，真菌感染小鼠的尸体全部浇乙醇火烧处理。

1.2.3 肾脏活菌落数目（CFU）检测 给药7 d后停药，最后一次给药24 h后处死30只（5只/组），取双肾脏，称重后，剪开，以5ml 0.9%生理盐水匀浆，再分别以0.9%生理盐水将匀浆液稀释103、104倍等，得到不同数量级稀释倍数的匀浆液，各取100 μl涂铺于SDA平皿上，于30℃真菌培养箱中培养48 h后计数菌落数目，以SDA平皿上生长菌落数达20个为最低限。计算肾脏活菌落数目（CFU），以log10 CFU/g 作图，并做 Student's t test检验[4]。

计算公式：CFU/g=菌落数×稀释倍数×50/肾重量（g）。

1.2.4 肾脏组织切片病理检查 给药7 d后停药，最后1 d给药24 h后麻醉并颈部脱臼处死30只真菌感染ICR小鼠，每组5只，取肾脏，肾脏组织经由10%中性缓冲福尔马林液中固定、取材、酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片，厚度10 μm，切片做HE染色（苏木素－伊红染色），于显微镜下观察肾脏组织病理变化并拍照片。

1.3 统计学处理 计算肾脏活菌落数目（CFU），以log10 CFU/g计算，t检验。

2 结 果

2.1 系统性真菌感染小鼠的治疗存活时间 盐酸小檗碱单独治疗组的平均存活时间与模型组无显著性差异（P>0.05），分别为3.5 d和3.4 d。氟康唑单独治疗组平均存活时间9.9 d，合用1组平均存活时间为12.7 d，合用2组平均存活时间16.1 d（图1、2），合用 3组平均存活时间 18.7 d（图2、3）。 两药合用组的存活时间明显长于氟康唑单独治疗组，其中合用2、3组与氟康唑单独治疗组相比具有统计学差异（P<0.05 或 0.01）。

图1 合用1组生存率比较线图

图2 合用2组生存率比较线图

图3 合用3组生存率比较线图

2.2 真菌感染小鼠肾脏的活菌数检测和肾脏组织病理检查 肾脏的活菌数检测换算为log10CFU/g作图（图4），盐酸小檗碱单独治疗组的log10CFU/g平均值6.566与模型组6.462相比没有显著性差异 （P>0.05）。单独氟康唑组活菌数平均值为5.966，合用1～3 组活菌数平均值分别为：5.723、5.645、4.967，均与单独氟康唑组相比有统计学差异 （P<0.05或0.01）。尤其高剂量小檗碱与氟康唑合用组疗效更好（图4）。

图4 肾脏中活菌数的log10CFU/g图

2.3 肾脏病理切片HE染色 结果显示6组小鼠均具有肾病形态特征：肾小球轻度肿胀，肾小管轻度变性肿胀，部分扩张，间质灶性炎症，中性粒细胞居多，伴有灶性脓肿样病灶形成，各组病变性质相似，以模型组为最重，两药合用组最轻，其它组基本相近（图5）。模型组为肾髓质内广泛炎性病变；单用盐酸小檗碱组肾髓质部肾小管上皮变性坏死、脱落；单用氟康唑组肾髓质内有脓肿形成；合用1组肾髓质内有脓肿形成；合用2组肾髓质内有炎性病变，但未见脓肿形成；合用3组肾曲管上皮有轻微变性，但未见脓肿形成。

图5 肾脏病理切片HE染色（10×20）

3 讨 论

以编号0304103的临床耐药白念珠菌建立ICR小鼠系统性真菌感染模型，并进行体内实验，研究氟康唑、盐酸小檗碱单用以及合用对感染白念珠菌小鼠的治疗情况。给药剂量和给药途径均在参考相关文献的基础上进行预实验后确定[5]。体内实验主要观察小鼠存活时间，由于真菌感染小鼠体内真菌在肾脏的聚集较多、损伤较重，因此笔者还检测了肾脏内活菌数目（CFU）以及肾脏病理变化。结果显示两药合用组的存活时间明显长于氟康唑单独治疗组，且具有剂量依赖性。两药合用2、3组的肾脏内活菌数目明显低于单药治疗组，肾脏病理切片的HE染色检查结果显示各组病变性质相似，但以模型组为最重，间质灶性炎症伴有灶性脓肿样病灶形成；两药合用组最轻，未见脓肿形成。以上结果说明氟康唑合用盐酸小檗碱后对系统性真菌感染小鼠具有增强疗效的作用，以大剂量盐酸小檗碱合用氟康唑治疗效果最佳。这种疗效的增强，一方面是由于氟康唑与盐酸小檗碱协同抗菌作用，另一方面小檗碱对免疫的调节作用可能也增强了小鼠对抗真菌感染的能力。有研究报道小檗碱能够增强小鼠的非特异性免疫反应，增强单核吞噬细胞系统的功能可能由于小檗碱自身结构中的季铵离子减弱了异物与细胞间的静电斥力，使异物易与吞噬细胞表面相应受体结合而促进吞噬作用[6，7]。

目前抗真菌药的联合应用已经成为临床抗真菌治疗的发展方向之一，但是现有的报道多局限于少数抗真菌药物之间的联合应用，有关针对耐药白念珠菌的联合用药报道较少，而且有些抗真菌药物合用后反而产生相互拮抗的作用[8，9]，因此目前急需研究出新的安全有效的联合用药方案。由于临床滥用抗生素，白念珠菌耐药性的产生越来越普遍，并已经成为临床真菌感染治疗的致命难题，本课题研究为对抗氟康唑耐药的临床白念珠菌提供了新思路；但其协同作用的机制仍不清楚，还需要进行进一步的深入研究。另外体外药敏和动物实验结果与临床疗效的相关性还是未知的，因此对于联合用药还需要大样本的临床应用，进行疗效验证及其可行性研究。

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