TAT-N24穿膜融合多肽对HepG2细胞增殖的影响*

邓豫 王桂华 金源 李小兰 陶德定 李维娜 龚建平 胡俊波

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI3K）是细胞信号转导通路中的重要蛋白，在细胞增殖、凋亡、分化及糖代谢等方面发挥重要的调节作用[1]。PI3K活性与多种人类肿瘤的发生发展密切相关[2，3]。p55PIK是IA型PI3K的调节亚基之一。本实验室构建了能够高表达其氨基端的24个氨基酸的腺病毒表达载体（Ad-N24）[4～6]，并证明其能够抑制肝癌细胞的增殖[7]。由于病毒类载体的生物安全性问题影响了其应用，我们又合成了TAT-N24 穿膜融合多肽（简称 TAT-N24）[8，10]。本实验检测了肝癌HepG2细胞周期、DNA合成能力及AKT磷酸化状态，初步探讨了TAT-N24对HepG2细胞增殖的影响及其作用机制，为开发安全、有效的肿瘤分子靶向治疗药物提供理论依据。

材料与方法

一、细胞、试剂与仪器 HepG2细胞株由本室传代培养；高糖DMEM培养基购于Hyclone公司，小鼠抗人BrdU单抗购于Santa Cruz公司，FITC荧光标记的羊抗鼠二抗购自丹麦Dako公司，FACSort流式细胞仪由美国Becton Dickson公司生产。

二、细胞培养与处理 HepG2细胞用含10%小牛血清和抗生素（青霉素100U/ml及链霉素100μg/ml）的DMEM培养液培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞生长至融汇度为70%时加入TAT-N24多肽和对照多肽（终浓度为100μg/ml）处理24小时。

三、BrdU/PI双掺法测定细胞DNA合成 HepG2细胞经TAT-N24多肽和对照多肽处理24小时后，加入 BrdU（终浓度为 10μmol/L），30min后用 0.25%胰酶消化，收集细胞，PBS洗1遍，用75%冰乙醇固定，-20℃保存过夜。取固定后的细胞，PBS洗1遍，PBS-T（含0.1%BSA，0.2%Tween-20）洗1遍，2 mol/L盐酸作用 45min，以 0.1mol/L四氢硼砂（pH=8.0）洗 1遍，PBS-T（含 0.1%BSA，0.2%Tween-20）洗 1 遍，加鼠抗人BrdU一抗（1:100），37℃孵育2h，PBS洗3遍后再加FITC标记的羊抗鼠二抗（1:20），室温孵育1h，PBS洗 3 遍，加入碘化丙啶（Propidium iodide，PI，终浓度为 4μM）和 RNAase（终浓度为 2μg/ml），室温孵育15min，在流式细胞仪上检测。

四、Western blot检测相关蛋白表达 HepG2细胞用TAT-N24多肽和对照多肽处理24h后，用0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗2遍后，用适量RIPA细胞裂解液冰上裂解30min，12000rpm4℃离心10min，取上清，加等体积2×SDS上样缓冲液，混匀后置于100℃水浴5min。蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜转膜（350mA，90min），5%脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后孵育一抗（兔抗人GAPDH、总AKT及磷酸化AKT抗体），4℃过夜。次日用TBST洗3遍，然后加HRP标记的羊抗鼠二抗孵育，室温孵育2h后，TBST洗3遍，每次15min，最后用ECL显色液显影。

五、统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行t检验，P＜0.05定义为差异具有统计学意义。

结果

一、TAT-N24对HepG2 DNA合成的影响 空白组R2为42.7%±3.6%，对照组R2为38.2%±2.8%，而TAT-N24组R2为25.3%±2.7%，提示TAT-N24能有效抑制HepG2细胞DNA合成（图1）。

图1 TAT-N24对HepG2细胞DNA合成的影响

二、TAT-N24对HepG2细胞周期的影响 上述细胞经BrdU染色后，进行流式细胞仪检测，进行细胞周期分析。结果显示，空白组、对照组和TAT-N24组G0/G1期细胞比例分别为52.6%±4.7%、52.0%±4.6%和 68.6%±4.7%（图 2，均 P＜0.05），提示 TAT-N24 能有效阻滞HepG2细胞周期进程。

图2 TAT-N24对HepG2细胞周期的影响

三、TAT-N24对HepG2细胞AKT磷酸化的影响 细胞经处理后，收集细胞，提取蛋白并定量后进行Western blot检测，观察TAT-N24对HepG2细胞AKT磷酸化的影响。应用NIH Image J软件对结果进行定量分析，结果提示TAT-N24对HepG2细胞AKT磷酸化水平无明显影响（图3）。

图3 TAT-N24对HepG2细胞AKT磷酸化的影响

讨论

P55PIK是PI3K的调节亚基之一，与其它调节亚基一样具有较为保守的结构域，其氨基端（N端）的24个氨基酸是其区别于其它亚基的最重要的特征。在我们前期的研究中证实，利用质粒载体在细胞内外源性表达N24能够有效地抑制多种人类肿瘤细胞的增殖[11～14]。研究证实，利用腺病毒载体在肿瘤细胞内高表达这24个氨基酸能够抑制肝癌细胞的生长[7]，验证了针对P55PIK的肿瘤分子靶向治疗的可行性。考虑到病毒载体作为治疗手段存在生物安全性等不利因素，我们合成并纯化了TAT-N24穿膜融合多肽，该多肽能否同样抑制肝癌细胞的生长是我们主要讨论的问题。

本研究显示，TAT-N24能有效抑制HepG2细胞DNA合成，并阻滞细胞周期进程于G0/G1期，与腺病毒N24对HepG2细胞的作用类似。其可能的机制为：N24通过竞争性结合Rb蛋白，降低了p55PIK对Rb的磷酸化作用，进而影响Rb对细胞周期的调节，导致细胞周期被阻滞于G0/G1期，同时DNA合成受到显著抑制。此外，结果表明TAT-N24不影响细胞内AKT的磷酸化水平，提示TAT-N24未影响PI3K常规通路下游AKT的磷酸化水平，副反应可能较其它PI3K抑制剂小，这一点有待在动物实验中进一步证实。TAT-N24是一种有前景的特异性抑制PI3K信号转导的分子靶向药物。

本研究在体外实验初步证实TAT-N24具有抑制肝癌细胞增殖的作用，与腺病毒N24作用类似，这些结果需在体内实验中进一步证实其有效性、副反应及其生物安全性。

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