脂联素对结肠癌HT-29细胞的增殖及凋亡研究

王 政，罗和生

武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉433600

随着人民群众生活方式及饮食习惯改变，结肠癌发病率逐渐上升，成为仅次于肺癌、胃癌的居第三位的恶性肿瘤，对结肠癌发病机制的研究受到重视。近年流行病学研究表明，血清脂联素含量变化与某些恶性肿瘤如食管癌、胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌的发生发展存在一定联系［1-5］。基础研究也证实脂联素可以抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞的增殖［6-9］。本实验以体外培养的人结肠癌HT-29细胞为观察对象，观察不同浓度脂联素对HT-29的生长及凋亡作用，为结肠癌的发病机制和治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系和试剂 HT-29细胞购自中南大学湘雅医学院细胞中心，RPMI 1640购自杭州吉诺公司，胎牛血清购自Gibco公司，人重组脂联素蛋白购自Peprotech公司，MTT购自Sigma公司，AnnexinV-FITC试剂盒购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人结肠癌细胞系HT-29细胞培养按ATCC培养方法，用RPMI 1640培养基培养，培养基中加入100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 IU/mL链霉素，在37℃、100 mL/L CO2的饱和湿度培养箱内培养;每10 d传代一次。正常生长状态下HT-29细胞形态为上皮样，单层贴壁生长，丧失接触抑制与密度抑制。取对数生长期细胞进行实验，用0.2%台盼蓝拒染方法鉴定细胞活力＞90%。

1.2.2 MTT法检测细胞生长增殖活性的影响:以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，培养过夜。加不同浓度全长脂联素(终浓度分别为0.01、0.1、1.0、10 mg/L，每组每个浓度点设4个平行孔;分别继续培养24、48 h。每孔加入 MTT溶液(5 g/L)10 μL，37℃孵育4 h后，每孔加入100 μL Formanzan溶解液37℃孵育4 h;用多功能酶标仪在570 nm处测定吸光度(OD值)，计算抑制率。抑制率(%)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100%。实验重复5次。

1.2.3 流式细胞分析仪检测细胞凋亡:以每孔5×105个细胞接种于6孔板，培养24 h后加入浓度为10 mg/L脂联素的培养基，不含脂联素的培养基为对照组，继续培养48 h，0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次。按试剂盒说明进行操作并用流式细胞仪检测凋亡百分比。实验重复4次。

2 结果

2.1 全长脂联素对HT-29细胞生长有抑制作用MTT检测结果显示全长脂联素干预细胞后，HT-29细胞的增殖活性受到抑制。不同浓度的全长脂联素干预HT-29细胞24 h后，浓度为0.01、0.1、1.0 mg/L的全长脂联素不能抑制细胞增殖;浓度为10 mg/L全长脂联素抑制细胞增殖，差异有显著性。用不同浓度的全长脂联素干预HT-29细胞48 h后，结果发现浓度为0.01、0.1 mg/L的全长脂联素不能抑制增殖;浓度为1.0 mg/L、10 mg/L全长脂联素抑制细胞增殖，差异有极显著性(见表1)。全长脂联素对HT-29细胞生长抑制曲线表明不同浓度全长脂联素干预HT-29细胞24 h后，增殖抑制率分别为 1.58%、7.96%、12.20%和13.71%;不同浓度全长脂联素干预HT-29细胞48 h后，增殖抑制率分别为 7.88%、8.42%、18.82%和27.96%(见图1)。

表1 不同浓度全长脂联素干预HT-29细胞24 h及48 h对生长增殖的影响(±s)Tab 1 Effects of adiponectin on proliferation of HT-29 cells

表1 不同浓度全长脂联素干预HT-29细胞24 h及48 h对生长增殖的影响(±s)Tab 1 Effects of adiponectin on proliferation of HT-29 cells

注:与对照组相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01

组别 OD值(24 h) OD值(48 h)0.204±0.029 0.558±0.061脂联素组0.01 mg/L 0.203±0.022 0.514±0.082 0.1 mg/L 0.187±0.027 0.512±0.064 1.0 mg/L 0.179±0.022 0.453±0.081＊＊10 mg/L 0.176±0.011* 0.402±0.057对照组＊＊

图1 不同脂联素浓度对HT-29细胞生长抑制曲线Fig 1 The growth curve of HT-29 cells treated with different concentration of adiponectin

2.2 脂联素对HT-29细胞凋亡的影响 对照组细胞的早期凋亡率为3.07%，10 mg/L全长脂联素干预组的细胞早期凋亡率为8.96%，差异有极显著性(见图2、3)。

3 讨论

脂联素是1996年发现的一种新的脂肪细胞因子。在机体内参与能量代谢、炎症反应等重要的生理过程。脂联素是血液中含量比较丰富蛋白，人体脂联素约占血浆蛋白总量的0.01%，正常人血浆浓度范围为1.9～17.0 mg/L。脂联素与人类不同疾病发生和发展有一定的关系，体内低脂联素与肥胖、糖尿病和冠心病有直接关系。进一步的研究表明脂联素浓度与乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌的发病呈负相关，低脂联素与肿瘤的大小和分期呈正相关。基础研究证实脂联素抑制多种肿瘤细胞的生长增殖活性，诱导细胞的凋亡。

本实验采用不同浓度的脂联素处理HT-29细胞后，脂联素对细胞生长抑制作用随着药物浓度的增加、作用时间的延长而升高，表明脂联素对HT-29细胞的增殖抑制作用呈时间、剂量依赖性，随作用时间延长、浓度的升高，其抑制作用增加。用浓度为10 mg/L处理细胞后，细胞的凋亡率较对照组明显升高，可见脂联素能够增加HT-29细胞凋亡率。以上结果表明脂联素能够抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。

Grossmann等［7］研究了脂联素对脂联素5种乳腺癌细胞的增殖抑制情况。结果发现脂联素对MCF-7细胞增殖抑制效果最明显，对MDA-MD-231细胞及MDA-MB-231增殖无抑制作用。而Kang等［9］发现脂联素可以抑制MDA-MD-231细胞增殖、诱导细胞凋亡;其中30 mg/L脂联素对细胞的增殖抑制率为30%，凋亡率为 27%。Dieudonne等［6］用 2.5 ng/mL的脂联素处理人乳腺癌MCF-7细胞后，细胞抑制率达40%，250 ng/mL脂联素处理细胞后，凋亡率为37%。Ishikawa等［8］用10 mg/L的脂联素对胃癌AZ521细胞无抑制作用，3 mg/L的脂联素对胃癌HGC27细胞抑制率约30%，30 mg/L的脂联素对细胞抑制率约90%;30 mg/L脂联素可明显诱导细胞凋亡，凋亡率达60%。本研究发现当脂联素浓度为10 mg/L时，对细胞抑制率为27.96%;凋亡率为8.96%。可见，脂联素对各种肿瘤细胞的生长增殖活性及凋亡的影响不尽相同。

进一步的研究表明脂联素抑制细胞增殖和诱导凋亡是通过脂联素受体［8］进行的。脂联素通过脂联素受体进行细胞信号转导，可以激活AMPK信号通路［8，10］、ERK 信号通路［11］和阻断 JNK 信号通路［7］，影响Bcl-2、Bax和P53基因的表达，降低 CyclinD1和cmyc基因的表达［6］。

总之，脂联素可以抑制结肠癌细胞株HT-29增殖和诱导其凋亡。加深对脂联素作用机制进一步研究，将为以后的脂联素应用于临床提供理论依据。

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