应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒

颜丕熙，李国新，吴晓刚，闫丽萍，滕巧泱，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

2010年春季以来，上海市、江苏省、浙江省、安徽省等地相继爆发一种导致蛋鸭减产、生长迟缓和死亡的一种新发病，研究证明引起该病的病原为坦布苏病毒（Tembusu virus）[1,2]。该病毒可经空气传播，对蛋鸭及肉鸭均有致病力。病鸭主要表现为高热、运动障碍、食欲下降甚至废绝、产蛋下降甚至停止，严重可导致死亡，死亡率可达5%～10%。剖检可见脾脏明显肿大；肝脏出血严重，伴有针尖状白色坏死点；卵巢发生出血、萎缩、破裂，输卵管有粘液[1,2]。由于该病毒为新发病原，目前尚无可靠的检测方法。本研究组曾使用RT-PCR方法对临床样品进行检测，但发现RT-PCR的敏感性比较差，不能有效的检测出该病毒。近年来套式RTPCR在疾病的诊断方面显示出灵敏、特异的优点，在登革热病毒[3]、蜱传脑炎病毒[4]和西尼罗病毒[5]等黄病毒的检测中都得到了很好应用。鉴于此，本研究建立了套式RT-PCR方法，该方法能够快速、敏感、特异地检测出鸭坦布苏病毒，为该病快速诊断与流行病学调查奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 鸭坦布苏病毒的增殖 鸭坦布苏病毒（FX2010）由本研究室分离鉴定。取保存的病毒液100 μL接种9日龄SPF鸡胚，收集24～120 h死亡鸡胚胚体，胚体研磨后，7500×g离心30 min，吸取上清，滴定病毒含量后，用于后续试验。

1.2 引物设计 根据坦布苏病毒（FX2010）E基因序列设计两对特异性的重叠引物（表1），引物由上海Invitrogen公司合成，用DEPC水稀释至终浓度为10 μmol/L，分装后冻存于-20℃。

1.3 病毒RNA的提取 取1.5 mL Eppendorf管，向其内加入500 μL上述病毒液、800 μL Trizol(Invitrogen)，静置5 min；加入0.2 mL氯仿，振荡15 s，静置2～3 min；4℃离心10 min，吸取上清并加入等体积的异丙醇，沉淀10 min；4℃ 10 800×g离心10 min，弃上清，用75%酒精清洗沉淀，混匀后，10 800×g离心10 min；倒掉上清，RNA自然干燥，用20 μL DEPC水溶解RNA。

1.4 反转录 将5μL RNA提取液与2 μL Random 9（TaKaRa）混匀，70 ℃保温10 min，迅速冰浴2 min，然 后 分 别 加 入 4 μL 5×AMV Buffer、1μL RRI、1μL AMV（Takara）、1 μL 10 umol/L dNTP、6 μL DEPC水，共20 μL，混匀后30 ℃保温10 min，42 ℃1 h，75 ℃ 10 min。

1.5 套式RT-PCR方法的建立 第一轮PCR采用25 μL反应体系：12.5 μL PCR Mix（东盛生物），1 μL P1（10 umol/L），1 μL P2（10 umol/L），1 μL cDNA模板，灭菌ddH2O补加至25 μL。置于PCR仪中，94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行25个循环；最后72 ℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统进行拍照。第二轮PCR采用25 μL体系：取第一轮PCR反应液1 μL为模板，12.5 μL PCR Mix、1 μL P3（10 umol/L）、1 μL P4（10 umol/L），灭菌ddH2O补加至25 μL，置于PCR仪中。94 ℃预变性 4 min；94℃变形 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，进行25个循环；最后72 ℃延伸10 min。1.0%琼脂糖电泳，并用凝胶成像系统进行拍照。

1.6 套式RT-PCR与普通PCR敏感性比较 取病毒液进行10倍系列稀释（表2）。每个稀释度取200 μL按上述方法进行RNA提取及反转录，所获得的cDNA取1 μL作为模板，用引物P1、P2进行第一轮扩增，反应结束后进行电泳检测。以第一次PCR产物（1μL）为模板，用引物P3、P4进行套式RT-PCR扩增。同时利用1μL cDNA作为模板，用引物P3、P4进行普通PCR扩增。反应结束后进行凝胶电泳检测。

1.7 特异性实验 以禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、鸭肝炎病毒等病毒的核酸反转录产物为模板，按上述方法对其进行PCR扩增，每次扩增设双蒸水作阴性对照，鸭坦布苏病毒反转录cDNA为模板作为阳性对照，扩增反应结束后用凝胶电泳检测。

1.8 临床应用 从安徽省、河北省、山东省、 浙江省、上海市等地发病鸭场采取病鸭脾脏组织，按1g/mL PBS加入PBS进行研磨，4℃ 10 800×g离心10 min。取200 μL上清按上述方法提取病毒RNA及反转录，随后进行套式RT-PCR检测，扩增反应结束后进行凝胶电泳检测。将阳性病料接种8日龄SPF鸭胚后分离该病毒，并应用该套式RT-PCR方法对分离病毒的鸭胚尿囊液进行检测，以确定病毒分离结果。

表1 PCR扩增所需特异性引物Table1 The specific primers for PCR amplication

2 结果

2.1 套式RT-PCR与普通PCR敏感性的比较 将毒价为105.25ELD50/100 μL的病毒液做10倍系列稀释，每个稀释度取200 μL提取RNA，反转录后取1 μL（见表2）为模板，进行第一轮扩增。凝胶电泳结果显示，只有毒价为2×105.25/100μL的病毒可以获得962 bp的目的条带（图1A）。用引物P3和P4进行第二轮扩增，结果显示，毒价为2×103.25/100 μL的病毒可以获得300 bp的目的条带（图1A）。而直接用引物P3和P4进行普通PCR扩增，病毒滴度达到2×104.25/100 μL时才可获得特异条带（图2）。结果表明套式RT-PCR扩增的敏感性较常规的PCR方法高10倍 （表2）。

表2 套式RT-PCR的敏感性Table 2 Sensitivity comparison between nested RT-PCR assay and RT-PCR

2.2 套式RT-PCR的特异性 以禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、鸭肝炎病毒等病毒的核酸反转录产物为模板，同时以双蒸水作阴性对照，以鸭坦布苏病毒做阳性对照，按上述方法对其进行PCR扩增，结果见图3。试验结果显示此PCR反应对鸭坦布苏病毒具有特异性。

2.3 临床样品检测 应用该套式RT-PCR方法对浙江省、上海市、山东省、河北省、安徽省等送检的病料进行PCR扩增，结果阳性病料可获得了300 bp的目的片段，阳性检出率为48/63，与病毒分离率为13/63，结果见表3。

表3 临床样品检测Table 3 The detection of clinical samples by nested RT-PCR

3 讨论

鸭坦布苏病毒是2010年新发现的一种病毒。目前所知，该病毒主要侵害鸭，尤其是蛋鸭，可使蛋鸭采食量下降、生长迟缓、体重下降、产蛋减少甚至停止，并能导致一定的死亡率。剖检病理特征主要是脾脏肿大、肾脏肿大、严重者肝脏后期有针尖状白色坏死点等。该病毒的致病特点和机理目前尚不十分清楚。目前中国多数地区都遭受该病的影响，给蛋鸭养殖业带来了极大的损失。

对于该病的诊断，采用传统的病毒分离方法费时费力，并且敏感性低。本研究建立了RT-PCR方法和套式RT-PCR方法检测该病毒，并对两种方法的敏感性作了比较。结果显示，套式RT-PCR方法比RT-PCR方法1（引物P1、P2）敏感性高100倍，比RT-PCR方法2（引物P3、P4）敏感性高10倍。在特异性试验中阳性病料可获得300 bp的目的条带，而禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、鸭肝炎病毒等的扩增结果均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。应用该套式RT-PCR对临床病料进行检测验证，结果表明该套式RT-PCR是检测鸭坦布苏病毒的有效手段，可用于鸭坦布苏病毒的临床诊断和分子流行病学调查。同时，应用该方法可以对病毒分离进行检测与验证。综上所述，本研究所建立的套式RT-PCR能快速、灵敏、特异地检测出鸭坦布苏病毒，将为该病的防治与防控发挥重要作用。

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