ELISA一步法和二步法检测乙肝HBsAg的结果比较

杨剑

(江西省萍乡市人民医院检验科，江西萍乡 337000)

依据 《中华人民共和国药典》2010年版三部规定反应时间的设置：检测过程中加入检测样本后反应时间应不低于60min，加入酶结合物后反应时间应不低于30min，加入显色液后显色时间应不低于30min[1]。江西省萍乡市人民医院检验科乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)由一步法换为二步法，均由上海科华生物工程股份有限公司生产。笔者在使用过程中发现一步法试剂盒假阳性率明显高于二步法试剂盒，而且一步法试剂盒在检测某些高滴度标本时存在严重的钩状效应，造成假阴性；二步法试剂盒在检测某些低浓度标本时存在检测OD值较低的现象，很容易造成漏检现象的发生。

1 材料与方法

1.1 样本 2724份血清标本均来自江西省萍乡市人民医院2011年6月份及7月份上旬的肝病门诊和住院患者，年龄在20～60岁之间，其中有1315份携带乙肝病毒 (因主要是肝病患者，故阳性率偏高)，1409份未携带乙肝病毒。患者携带乙肝病毒是指一步法与二步法HBsAg同为阳性或一者为阳性时经PCR定量检测出HBV病毒量确认的。

1.2 试剂和仪器 1)乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)，购自上海科华生物工程股份有限公司；2)伯乐680酶标仪，购自美国伯乐公司；3)安图fluido2010洗板机，购自奥地利安托斯公司。

1.3 方法 两种方法均严格按照对应试剂盒内使用说明书操作，每批试验均做室内质控。同时采用上海科华试剂检测 HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb。

2 结果

对2724份血清标本检测后的结果进行处理后，发现其中有3例一步法HBsAg检测为阴性，但HBeAg，HBcAb为阳性，经标本稀释后重测，结果HBsAg阳性；而二步法检测出HBsAg为阳性。同时，两种方法对乙肝HBsAg阳性标本1319例检测出的OD值比较发现：一步法OD值(OD1)大于二步法OD值(OD2)有1047例，而OD1＜OD2仅272例。并且二步法检测的HBsAg阳性OD值有574例低于HBeAgOD值。另外一步法和二步法两者假阳性率采用χ2检验，比较有显著性差异(P＜0.01)，结果见表1。

表1 两种方法对2724份血清标本HBsAg的检测情况

3 讨论

一步法操作简单省时，能够满足临床快速、简便的要求。与二步法的主要区别在于一步法测定体系中同时加入待测标本(含抗原)和酶标抗体进行竞争反应，当待测标本抗原浓度很高时，会形成竞争抑制作用，导致显色反应降低甚至不显色，出现假阴性，这种现象又被称为钩状效应(hook effect)。钩状效应是ELISA一步法检测抗原(抗体)存在的普遍现象，曾有实例报道[2]。另有报道[3]，ELISA法检查HBsAg二步法操作可以避免检测试剂对待测成分的稀释，以及检测试剂中的酶标抗-HBs抗体相对过剩产生的HOOK效应。本实验中有3例一步法HBsAg检测为阴性，但HBeAg，HBcAb为阳性，经标本稀释后重测得出HBsAg阳性；而二步法检测出的HBsAg为阳性，笔者认为是因钩状效应而发生的。

从本次实验结果可知，一步法OD值(OD1)大于二步法OD值(OD2)有1047例，而OD1＜OD2仅272例，说明二步法检测的OD值较一步法偏低。笔者认为可能二步法由于其特异性稍差[4]造成的。近年来，抗病毒药物在临床广泛应用，乙肝表面抗原弱阳性结果的比率也在随之增高。因此二步法虽然可以避免钩状效应的发生，但由于对于低浓度标本因OD值较低的现象，假阴性率稍高，容易造成漏检现象的发生，因而也存在一定的缺点。笔者在有关文献[5]中看到：溶血标本对ELISA一步法干扰明显高于二步法，由于实验条件的限制，本研究有待以后完善。总的说来，二步法虽然操作上增加了一步，检测时间稍长，也存在漏检现象的可能，但综合效果优于一步法，更适合于HBsAg的检测。

乙肝表面抗原假阴性结果造成临床误判，延误患者病情；乙肝表面抗原假阳性结果对被检者造成巨大的心理压力，造成治疗药物的滥用及浪费，并且可能对被检者造成身体伤害。因此，对乙肝表面抗原进行确认是必需的[6]。但由于一步法与二步法各有优缺点，笔者认为必要时，也需要将一步法与二步法结合考虑使用，甚至采用更先进的方法，比如化学发光法和实时荧光PCR定量检测。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典((三部).[M].北京:中国医药科技出版社,2010:355.

[2]陈仁杰,胡海燕,严银燕.ELISA一步法检测梅毒抗体钩状效应三例[J].实验与检验医学,2008,26(2):215-216.

[3]雷 震,谢 楠,敖琴芳,等.加酶时间对ELISA定性测定HBsAg的影响[J].现代检验医学杂志,2007,22(5):20-22.

[4]王火生,李丽雄,林 萍,等.一步法ELISA在HIV初筛中的应用探讨[J].中国实验诊断学，2006,10(5)：501-503.

[5]薛俊太,邓翠华,王 惟,等.溶血标本在ELISA一步法和二步法中队HBVM测定结果的影响[J].检验医学与临床,2009,6(14):1126-1127.

[6]雷 震,谢 南.抗-HBs抗体阳性血清中和确认HBsAg方法的建立[J].实验与检验医学,2008,26(6):677-678.