鲍曼不动杆菌整合子与耐药性的相关性研究

吴长生，伍严安，胡辛兰，李 宁

(福建省立医院检验科，福建福州 350001)

鲍曼不动杆菌是一种条件致病菌，对目前常用的多种抗菌药物耐药。整合子是一种与耐药基因水平传播有关的新的可移动基因元件，携带位点特异性重组系统组分，根据整合酶基因的DNA碱基序列的不同，整合子可以分为4类：I类、Ⅱ类、Ⅲ类和Ⅳ类整合子。I类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子与细菌耐药关系比较密切，又常被合称为耐药整合子(resistance integron，RI)。本研究通过简并引物PCR法，调查福建省立医院患者的标本中分离的鲍曼不动杆菌携带整合子的情况，并分析整合子与细菌耐药性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 93株鲍曼不动杆菌为2007年11月至2008年10月，从福建省立医院临床标本中分离，剔除耐药表型完全一致的菌株。I类整合子阳性标准菌株V517由华南理工大学轻工与食品学院石磊教授惠赠，Ⅱ类整合子阳性对照株由福建CDC惠赠。

1.1.2 仪器 VITEK 2全自动细菌鉴定和药敏分析仪 (法国bioMerieux公司)，BIOER Tc-25/H 基因扩增仪 (杭州博日科技有限公司)，FX-DY-252型水平电泳仪(上海复星高科技集团有限公司)，凝胶成像系统(UVItec limited)。

1.1.3 试剂 VITEK 2全自动细菌鉴定和药敏分析仪所用试剂为法国bioMerieux公司产品。药敏纸片和M-H(Mueller-Hinton)琼脂为英国Oxoid公司产品。Chelexl00为BIO-RAD公司产品。Taq DNA聚合酶，dNTPs，Taq buffer(Mg2+Plus)，Hinf I 等均为TaKaRa公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定和药敏试验 采用VITEK 2全自动细菌鉴定和药敏鉴定和药敏分析仪，进行细菌鉴定和抗菌药物敏感性测定。每批均以铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株进行质量控制，结果按美国临床实验室标准协会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准进行判读[1]。

1.2.2 细菌总DNA的提取 采用Chelex100法[2]，提取的细菌DNA，用紫外分光光度计测量260nm、280nm OD 值，OD260/OD280为 1.66～1.70。

1.2.3 整合子检测及分类 参照文献设计简并引物[3]，由宝生物工程(大连)有限公司合成。上游引物为 hep35：5′-TGCGGGTYAARGATBTKGATTT-3′，下游引物为 hep36：5′-CARCACATGCGTRTARAT-3′，该引物可同时扩增整合子5’保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因，预计扩增片段为491bp。参考有关文献[4-5]，采用25μl反应体系：上下游引物(l0μmol/L) 各 1.0μl，模板 1.0μl，dNTPs(200μmol/l)2.0μl，Taq buffer(Mg2+Plus)2.5μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.125μl，超纯水 17.375μl。参考有关文献[5，6]和对循环条件的优化结果，确定以下PCR反应条件：94℃预变性 5min；94℃ 30s，52℃ 40s，72℃ 40s，循环35次；最后72℃延伸5min。简并引物扩增的阳性产物用限制性内切酶Hinf I进行限制性片段长度多态性 (RFLP)分析， 酶切反应体系：PCR产 物8.0μl，10 × H Buffer 2.0μl，Hinf I(l0U/μl)1.0μl，超纯水9.0μl。37℃水浴4h，酶切产物用含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析 (电压70V，时间30min)，对整合子进行分类，依据见表1[3]。

表1 整合子酶切分类依据

1.2.4 统计学分析 统计分析采用SPSS 13.0软件，率的比较用卡方检验或Fisher确切概率法检验。

2 结果

2.1 整合子检测及分类结果 在93株鲍曼不动杆菌中有22株检出整合子，检出率为23.6%，整合子检测电泳图见图1。PCR-RFLP结果显示均为Ⅰ类整合子，未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子，整合子酶切分类电泳图见图2。

图1 整合子检测电泳图

图2 整合子扩增阳性产物酶切后电泳图

2.2 I类整合子与鲍曼不动杆菌耐药和多重耐药的关系 对I类整合子阳性和I类整合子阴性的鲍曼不动杆菌的药敏情况进行分析，结果显示：哌拉西林、替卡西林/棒酸、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、左旋氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明共11种抗菌药在整合子阳性组的耐药率明显高于整合子阴性组，具有统计学意义(P＜0.05)，详见表2。

在I类整合子阳性的22株鲍曼不动杆菌中，多重耐药菌有21株，占95.4%；而I类整合子阴性的71株鲍曼不动杆菌中，多重耐药菌只占74.6%。对二组细菌的多重耐药发生率进行比较，结果显示：I类整合子阳性菌株的多重耐药发生率比I类整合子阴性菌株高，两者有显著性差异(P＜0.05)，说明整合子与细菌多重耐药的发生有关，见表3。

3 讨论

表2 鲍曼不动杆菌I类整合子与耐药表型的关系

表3 二组细菌的多重耐药发生率的比较

鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter baumanii，ABA)是引起医院感染的常见条件致病菌，在临床分离的非发酵菌中仅次于铜绿假单胞菌。ABA常可引起患有严重基础性疾病和重症监护室内使用呼吸机等侵入性装置的患者的感染。

本研究中，ABA的耐药现象十分普遍，多重耐药菌株占细菌总数的77.4%，对青霉素类、头孢菌素类、庆大霉素均具有很高的耐药率(＞70%)，耐药率较低的有头孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星，与国内相关报道相似[7，8]。

本研究应用的简并引物PCR法，可同时扩增整合子5′保守区的I类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因，再通过PCR-RFLP分析确定整合子的类别，可节省实验时间，降低成本，是一种对大量临床菌株进行整合子筛选的理想方法。

本研究结果显示，ABA中整合子的检出率为23.6%，酶切结果显示均为Ⅰ类整合子，明显低于国内的相关报道[9]，而高于国外的相关报道[10]，推测主要是与标本的选择和地域差异有关,本研究在收集标本时剔除了耐药表型完全相同的菌株，避免了同一来源菌株的重复收集；国内的相关报道阳性率高达90%，可能与阳性菌株的暴发流行有关；而国外相关研究的标本来自于不同国家不同医院。

细菌耐药性通常由获得耐药基因引起，在抗菌药物选择性压力下，耐药基因的水平传播是一个日益严重的问题，耐药基因的水平传播使耐药菌株广泛流行[11]。

整合子具有通过位点特异重组机制整合多个耐药基因盒的能力，介导多药耐药的形成。本研究中，许多抗菌药在I类整合子阳性组的耐药率明显高于阴性组，并且具有统计学意义；统计结果显示，整合子与细菌多重耐药的发生有关。

对整合子介导和传播耐药性的研究，有助于理解革兰阴性菌耐药性和多重耐药性的分子基础，为合理使用抗菌药物和控制细菌耐药性发展提供理论基础。

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