阿德福韦治疗HBV基因变异的临床观察研究

曹莉萍，叶 倩 ，陈光明 ，谭立明 ，刘 川 ，李 军

(1、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006；2、高安市瑞州医院，江西高安 330800)

慢性乙肝肝炎是我国乃至世界突出的公共卫生问题。抗病毒治疗一直被视为慢乙肝患者的主要治疗方法。核苷类似物--拉米夫定早期被认为是抗乙肝病毒首选药物，但随着对其认识深入及回顾研究发现，其致病毒基因突变很高。2005年，一种新的核苷类似物-阿德福韦(adefovir diivoxil,ADV)获得美国等多国FDA批准用于慢性乙肝的治疗。随着

ADV广泛的应用，耐药患者不断的增加，对其耐药基因的检测已显得尤为重要。目前得到学术界公认的耐药株有两种：rtN236T变异和rtA181V变异。本课题组采用国际上先进的巢式聚合酶链反应—限制性片段长度多态技术(ntPCR-RFLP)技术对治疗的不同阶段患者进行该两种耐药株进行检测，旨在了解接受阿德福韦治疗后HBV的基因变异情况。

1 材料与方法

1.1 病例来源

来自南昌大学第二附属医院住院及门诊2007年1月至2009年1月收治的100例慢性乙肝患者，其中5例未能坚持随访。所有入选病例均单用阿德福韦酯治疗(10mg、每日一次，疗程大于6个月)，男性 67例，女性33例，年龄19～68岁。慢乙肝诊断符合2000年全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的诊断标准[1]。HBeAg均阳性，血清HBV-DNA水平≥103拷贝/ml，伴有 ALT升高2～10倍；肾功能正常；超声CT检查均无明显的肝内占位证据。排除标准：①其他肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒等重叠感染；②失代偿期肝硬化，肝癌，乙醇性或自身免疫性肝病，妊娠或哺乳期妇女等；③半年内应用过于扰素、免疫调节剂或其他核苷类抗HBV药物。

1.2 主要试剂与仪器

低温高速离心机 (美国Beckman公司)；DNA回收试剂盒 (美国OMEGA公司)；核酸提取试剂盒及HBV-DNA荧光定量试剂盒 (深圳匹基生物技术有限公司)；低温高速离心机(美国Beckman公司)；DNA回收试剂盒 (美国OMEGA公司)；MyCycler型基因PCR扩增仪及Geldoc XR型凝胶成像及图像分析系统(美国BIOCAD公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取：采用异硫氰酸胍一步法提取血清中的DNA。待检血清50μl加入含4mol/L异硫氰酸胍的裂解液 60ml，37℃温育 10min；加入酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)50μl，震荡混匀后13000r/min离心10min；取上清，加入等量异丙醇，-20℃沉淀2h，13000r/min离心10min，弃上清，室温干燥后加入双蒸水 20μl溶解，-20℃保存。

1.3.2 引物设计：检索GenBank收录的HBV基因全序，采用Primer Premier5.0及Oligo 6.67软件辅助分析，设计巢式PCR引物(外引物：P1、P2，内引物：ADVup、ADVlow)；旨在使野生株(rt236N、rtA181V)PCR产物中含有Dral酶切位点(5TTTAAA3)而变异株无此限制性酶切位点。

1.3.3 PCR反应 以血清提取物为模板进行巢式PCR反应：30μl PCR反应体系含Taq酶1μ，10x扩增缓冲液 3μl，25mol/L dNTP 0.12μl、50μmol/L 引物0.12μl；第一轮PCR模板为血清提取物6μl，引物为P1，P2；第二轮PCR模板为第一轮PCR 产物3μl，引物为ADVup、ADVlow。两轮PCR循环温度条件均为94℃ 3min，94℃ 10s，53℃ 30s，72℃ 30s，共 30 循环，72℃ 7min。取第二轮PCR产物8μl，以10%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于紫外灯下观察结果，于304bp处出现荧光条带为阳性。

1.3.4 Dra I酶切 10μl酶切反应体系内含第二轮PCR 产物 8μl，Dra I 10U，酶切缓冲液 1μl，于 37℃酶切4h。

1.3.5 琼脂糖凝胶电泳 将9μl酶切产物以3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于紫外灯下观察结果。PCR产物经酶切后野生株较变异株缺失19bp，故电泳速度稍快，将标本同对照质粒相比较即可是否变异。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，采用均数比较t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

95例慢性乙肝患者接受ADV后，在不同治疗阶段检测累计基因变异情况见表1。

表1 不同治疗阶段检测基因变异病例数

3 讨论

慢乙肝是我国最常见的慢性传染性疾病，也是危及我国人群健康重要因素之一。目前对乙肝患者治疗尚无特效药物。部分患者可通过抗病毒治疗抑制或清除乙型肝炎病毒。既往报道提示[2]，抗病毒的应答与感染者个体因素以及病毒本身基因特性有关。长期用药可导致药物靶位单核苷酸变异，即基因变异，从而使病毒在机体内产生耐药。通常通过对治疗中发生病毒学突破的患者治疗前后HBV株的核苷酸及其编码的氨基酸比较分析而确定是否存在基因型耐药，然而阿德福韦酯只要1个位点突变就足以发生突变[3]。孙华宝等[4]认为基因变异不仅会引起病毒对该药物耐药，还可能导致病情的加重，故HBV基因变异的检测有重要的临床意义。

本实验通过对95例慢性乙肝患者在接受ADV治疗的不同阶段进行rtN236T变异和rtA181V变异的检测，结果显示疗程大于六个月即可产生基因变异，并随着疗程的延长，其变异率不断增加，即12、18、24个月变异率分别为 3.16%、6.32%、7.37%，研究提示阿德福韦治疗对HBV可产生一定的基因变异，与用药疗程有一定相关性。另国外研究者发现[5，6]，随着阿德福韦酯治疗疗程的延长阿德福韦酯耐药株也随之出现，服用阿德福韦酯治疗1～5年发生耐药为 0、2～3%、519～11%、18%、28%。二者比较可见，一方面提示阿德福韦治疗对HBV可产生基因变异与疗程相关；另从另一个侧面反映了ntPCRRFLP的灵敏性。此结果与李金明等[6]报道的使用基因芯片技术检测ADV治疗致乙肝病毒产生基因变异率大致相符。

目前，阿德福韦还是一种新的抗HBV药物，在临床使用时间还较短，关于阿德福韦的研究还主要侧重于耐药发生率、发生时间即耐药对病情和病毒复制的影响等方面的研究，至于阿德福韦应用与病毒变异之间的关系及发现方便、快捷的检测方法等仍需进一步研究、探讨。建立一个良好的监测机制、减少耐药性及耐药后相应对策的实施等有重要意义。

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