脑梗死早期侧支循环重建及电针干预效应研究*

李桂平，石 磊，杜元灏，李 颖

脑梗死即神经元、胶质和血管的死亡。在大脑组织中，神经元对缺血的耐受性最差，由于大脑几乎无能量储备，因而需要持续而充足的血液供应来维持功能，当血液或氧供应停止后，神经元在数分钟内即发生不可逆损伤[1]。由缺血、缺氧或低血糖等不同病因引起的脑梗死，虽然易损区和组织病理学表现各异，但其最终引起缺血中心部分的细胞由于缺氧而死亡，缺血半暗带的细胞由于继发的代谢改变而损伤。

脑梗死急性发生后，脑表面侧支血管系统犹如一个“闸门”，决定着脑缺血区能否及时有效地接受来自缺血周边区的侧支循环血流，并压送这些代偿血流进入微细血管，以营养缺血的神经元组织，“闸门”的机能状态决定着缺血细胞的命运。急性脑梗死发生后，造成“闸门”的阻力增大，开放不利，微血管自律运动出现高频率低振幅，其流质、流场的动态耦合发生障碍，表现为“高速低效震荡”，成为缺血脑组织获取代偿血流的障碍，因此，脑梗死发生后，如何迅速而有效的重建微血管侧支循环，恢复缺血区及半暗带的血流供应，成为治疗的关键。

本研究基于上述理论进行设计，拟达到以下目的：1）以凝集素组织化学技术显示微血管整体形态，建立可靠的实验方法。2）直观反映脑梗死后微血管的形态学变化以及针刺的干预效果，从血管量上反映侧支循环建立情况。3）根据脑梗死后电针干预效果，为针刺干预时机的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠（由中国医学科学院实验动物养殖中心提供），体质量180~200 g，随机分为模型对照组、电针干预组和空白对照组。模型对照组、电针干预组又分为1、3、6 h 3个时相组。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 主要仪器 LH202H型韩氏电针仪（中国北京）；Leica CM9100冰冻切片机；恒温孵育箱；微量进样器。

1.2.2 主要试剂 蕃茄凝集素（Lycopersicon esculentum agglutinin，Vector公司，产品编号：B-1175）；ABC 染色试剂盒(VECTORSTAIN ABC kit，Vector公司，北京中杉金桥生物有限公司分装，产品编号：PK-4002）；浓缩型二氨基联苯胺染色（DAB）试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司，产品编号：ZLI-9032）；0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）；其他试剂均为国产分析纯试剂。

2 实验步骤

2.1 模型复制 采用Longa的腔内线栓法阻滞大鼠左侧大脑中动脉，复制脑梗死模型，尼龙线直径为0.205 mm。大鼠经10%水合氯醛（0.003 mL/g）腹腔内注射麻醉，仰卧于手术台上，颈正中偏左侧切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉，颈总动脉近心端和分叉处放置动脉夹，在两动脉夹中间扎孔，插入尼龙线拴，长度18~22mm，线栓进入颈内动脉稍遇阻力即停止进线，结扎线拴和颈总动脉，放开颈总动脉近心端动脉夹，缝合皮肤。

2.2 模型纳入、排除标准 参照Longa 5分制评分标准，0分：无神经功能缺失症状；1分：轻度局灶性神经功能缺失（不能完全伸展右侧前肢，左侧Horner’s征阳性）；2分：中度局灶性神经功能缺失（提尾悬空时右前肢屈曲、内收，行走时向右侧转圈）；3分：重度局灶性神经功能缺失（站立不稳，向右侧倾倒）；4分：不能自发行走，意识水平降低。

评分在1～3分为造模成功，以下两种情况为模型复制不成功，予以剔除：1）实验过程中大鼠死亡。2）在规定时间处死动物，取脑时见有蛛网膜下腔出血或颈内动脉分叉部出血。

2.3 处理方法 电针干预组在大脑中动脉梗死（MCAO）后即刻电针刺激人中穴，人中穴定位按华兴邦的动物穴位图谱，用1.7 cm毫针在大鼠鼻中隔下方向上斜刺2 mm，并在该部位下约2 mm处刺入1针作为参考电极，人中穴接电针仪的正极，参考电极接负极，用15Hz，1mA的连续波刺激，持续20min；模型对照组和空白对照组均同样抓取固定，但不进行任何治疗。

2.4 样本制备 模型对照组、电针干预组分别在MCAO后1、3、6 h规定时间，于一侧股静脉注射生物素化番茄凝集素（1 g/L，溶于生理盐水)，2 min后，开胸行心脏灌注，灌注液为1%多聚甲醛与0.5%戊二醛混合0.01 mol/mL PBS缓冲液，130 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）压力连续灌注10 min，取脑，以大脑中动脉和大脑前动脉分叉部为中点前后各2 mm取中间一块脑组织，30%蔗糖脱水，冰冻切片，切片厚度35μm，连续切片20张，4℃丙酮固定10min，晾干后－20℃保存待检。

2.5 染色步骤 取冰冻切片，0.01 mol/L PBS缓冲液洗5min×2次；0.01×10-3mol/mLPBS缓冲液（含0.3%Triton X-100）中，37℃孵育4 h；滴加ABC复合物，37℃孵育1 h，0.01 mol/mL PBS缓冲液洗5 min×2次；滴加DAB染色试剂反应15 min；彻底水洗终止反应，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.6 图像分析 采用Image Pro-Plus图像分析系统，对每张切片缺血半暗带内分别随机选择5个视野进行测量，检测参数为血管量。

2.7 统计处理 采用SPSS13.0软件对各组数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析。

3 实验结果

采用Image Pro-Plus图像分析系统对图像进行分析，选择测量参数为血管总数，导出数据进行统计，结果见表1。

表1 缺血半暗带内有血流灌注的总血管量（s，n＝6）

表1 缺血半暗带内有血流灌注的总血管量（s，n＝6）

注：空白对照组有血流灌注的微血管数量平均为(317.00±7.40)，与空白对照组比较*P＜0.001，与模型对照组比较▲P＜0.01。

组别 梗死后1 h模型对照组 136.20±2.96*电针干预组 195.50±5.61*▲梗死后3 h 130.39±9.58*192.50±10.98*▲梗死后6 h 130.83±7.97*186.28±9.82*▲

采用凝集素组织化学技术对各组切片进行染色，空白对照组血管形态，模型对照组和电针干预组缺血半暗带内脑血管形态如图所示（图1、图2）。

图1 正常脑血管染色

缺血半暗带有血流灌注的为血管量统计结果显示：与空白对照组比较，模型对照组在MCAO后1、3、6 h血管量均显著减少，有统计学差异（P＜0.001），电针干预组与相对应模型对照组各时相比较，血管量均显著增加，有统计学差异（P＜0.01），但是仍显著少于空白对照组（P＜0.001）。

4 结论

电针干预可增加MCAO模型大鼠缺血半暗带内有血流灌注的微血管数量，提示电针干预可促进侧支循环建立，从而增加这一区域的脑血流灌注，并对梗死区产生一定的影响。

图2 MCAO模型缺血半暗带内微血管形态

5 讨论

脑梗死后，梗死区的微循环中，血流基本处于停滞状态，缺血半暗带微循环中，血流速度下降，细胞聚集度降低，越接近梗死区，下降幅度越大，呈现出一定的梯度变化，相比较其他部位血流速度和细胞聚集度而言，番茄凝集素更容易对这一区域的红细胞产生凝集作用，使得血流停滞，凝固，并且这种作用不同于一般的血液凝固，其作用力更强，通过心脏灌注的方法，在灌注压相同的情况下，由于灌注压在血管系统中遇到阻力逐级递减，至大脑微循环时灌注液不能将凝集素作用的血管中的血液冲洗掉。对于那些在凝集素静脉注射前血液已经凝固的血管，凝集素无法随着血液流动进入这些血管，则不能与特异性糖蛋白结合，最终这些血管中凝固的血液在灌注液的作用下被冲洗掉，但由于没有凝集素的结合，随后的染色反应中则不能染出。所以，根据凝集素的特殊反应原理，笔者认为最终通过凝集素组织化学染色出现的微血管，可以看作是脑梗死后仍有缓慢血液流动的部分血管，这部分微循环中的血液正是由侧支循环代偿而来，所以能够很好的反映脑梗死后缺血半暗带和梗死区的微循环状态，并以此推测侧支循环建立的情况及其代偿能力。

[1]James F Toole著，龙 洁译.脑血管疾病[M].第5版，北京：中国协和医科大学出版社，2004：5.

[2]宗静杰，褚 芹，郑建刚.“醒脑开窍”针刺法治疗缺血性中风作用机制研究进展[J].天津中医药大学学报，2010，29（3）：164-166.