高效液相色谱法测定牛黄化毒片中连翘苷含量*

孟凡英，张丽芳，侯 婷，王 佳，卢 珑

牛黄化毒片收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》，执行药品标准为WS3-B-3567-98。是由制天南星、连翘、金银花、白芷、甘草、乳香、没药、人工牛黄8味药材组成。有解毒消肿，散结止痛的功效，可以用于疮疡、乳痈、红肿疼痛的病痛的治疗。现执行的质量标准仅规定了性状及绿原酸的薄层色谱鉴别和检查项。为有效地控制药品质量，本文增加了连翘中连翘苷的含量测定方法。修订后的标准可用于牛黄化毒片的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（包括在线脱气机、四元泵、自动进样系统、DAD检测器、Chem Stations色谱工作站）。1.2 试药 连翘苷对照品（批号为110826-200712，供含量测定用，含量以99.9%计）均由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，水为去离子水。牛黄化毒片样品由（天津市同仁堂股份有限公司提供批号为 584004、783001、788002、885001）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性实验 色谱柱：Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（23∶77）；检测波长为230 nm；流速1.0 mL/min；柱温室温。进样量10 μL，灵敏度0.02AUFS。分别取样品测定项下溶液10 μL，各重复进样5次，记录色谱图，量出连翘苷的保留时间和半峰高宽，计算理论塔板数，结果其理论塔板数均大于2 000。连翘苷保留时间为25 min，拖尾因子亦符合药典规定。连翘苷的液相色谱图见图1。阴性对照图谱显示阴性的色谱峰。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取连翘苷对照品5 mg，置250 mL棕色量瓶中用50%甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，制成1 mL中约含20 μg对照品溶液。

2.3 供试品溶液及阴性对照品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，研细，精密称取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL，密塞，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，精密移取2 mL，上中性氧化铝柱（100~120目，1 g,内径 1 cm），用 50 mL 70%乙醇洗脱，蒸至约15 mL，置25 mL容量瓶中用70%乙醇定容。0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。同法，取不含连翘的样品制备成阴性对照品溶液。

2.4 线性考察 精密吸取连翘苷对照品溶液（468.5 g/L）1、2、3、6、9、12、15 mL，分别置 25 mL 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，分别配置成0.194 6、0.389 2、0.583 8、1.167 6、1.751 4、2.335 2、2.919 0 g/mL的溶液，按“2.1色谱条件”项下进样10 μL。进样后，记录峰面积，以浓度X与峰面积Y进行线性回归，得回归方程为Y=204298.1315X－3055.7124（r=0.9999）。结果表明连翘苷在0.194 6～2.919 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度实验 取批号为889002的样品1份，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法操作，按“2.1色谱条件”分析，精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定样品中连翘苷峰面积值，平均峰面积值为 78.634 522的峰面积（RSD）=0.22%（n＝6）。结果表明，精密度符合要求。

2.6 稳定性实验 取批号为889002的样品1份，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法操作，按“2.1色谱条件”分析，分别精密吸取供试品溶液10 μL，分别于 0、2、4、6、8、12 h 进样，测定连翘苷的含量RSD=0.87%，结果表明，供试品溶液在24 h内测定稳定。

2.7 重现性实验 取批号为889002的样品6份，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法操作，按“2.1色谱条件”分析，测定连翘苷的含量，结果测得样品平均含量为0.082 34 mg/片，RSD=0.67%，结果表明，重现性符合要求。

2.8 加样回收率实验 取批号为889002的样品6份，各1.0 g，精密称定，精密加入每1 mL含连翘苷对照品0.018 29 mg的甲醇溶液15 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，精密移取2 mL上中性氧化铝柱（100~120目，1 g，内径 1 cm），用 50 mL 70%乙醇洗脱，蒸至约15 mL，置25 mL容量瓶中用70%乙醇定容。0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得，作为供回收率测定用的供试品溶液，按“2.1色谱条件”分析，计算回收率。结果平均回收率为101.13%，RSD=0.76%。

2.9 样品含量测定 取不同批次的样品，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法进行处理，按“2.1中色谱条件”测得各自连翘苷的含量，结果见表1。

表1 牛黄化毒片连翘苷含量测定结果

3 讨论

通过对对照品溶液在波长200～400 nm处进行紫外光谱扫描显示，连翘苷在230 nm处有最大吸收。流动相的选择参考相关文献[1]，采用不含有缓冲盐的流动相，以保证色谱柱的使用质量，故最终将流动相定为乙腈-水（23∶77）。取同一批号（889002）2份，精密称定，色谱柱分别为phenomenex Luna C18250mm×4.6mm，5μm，Agilent ZORBAX SB-C184.6mm×250mm，5μm，Dikma DiamonsilC18（2）250mm×4.6mm，5 μm，结果平均总量为 0.082 07 mg/片，RSD=1.75%。使用不同色谱柱对含量测定无影响。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2005：109-111.