中药单体对HepG2细胞株脂代谢相关基因mRNA表达的影响*

王 威，王子旭，田 维，史 红，江海涛

近年来随着饮食结构和生活方式的改变，由高脂饮食和饮酒所致混合性脂肪肝及脂肪性肝炎呈上升趋势。各种原因引起肝内脂质堆积过多，使得肝脏总脂量超过肝质量的5%，即称为脂肪肝[1]。预防和治疗脂肪肝已经成为中、西医临床和基础研究的重要课题。张伯礼教授在多年临床实践的基础上提出以疏肝导浊法治疗脂肪肝。疏肝导浊方药由丹参、姜黄、荷叶、何首乌等中药组成，具有清热化湿、疏肝利胆的功效。临床实践及动物实验研究均证明，疏肝导浊方药对脂肪肝治疗有很好的疗效[2-3]。本实验研究以HepG2细胞株为研究对象，采用中药单体丹酚酸B、姜黄素、荷叶碱和何首乌碱对HepG2肝细胞株进行干预，观察疏肝导浊方药中每味中药单体对HepG2肝细胞株脂代谢相关基因PPARα、HL、ApoB100、ApoAII及 ApoCII表达的影响，进一步研究疏肝导浊方药治疗脂肪肝的作用机制。

1 材料

1.1 主要试剂 DMEM高糖培养基（GIBCO公司），小牛血清（Hyclone.com 公司）；胰酶（Gibio公司），胰蛋白酶（Sigma公司），DMSO（Sigma公司），HEPES（Sigma公司），噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）。

1.2 仪器 CO2培养箱，（FORMA3111，THERMO公司）；倒置相差显微镜，（LEICA DMIL，LEICA公司）；超净工作台，（苏州安泰公司）；激光共聚焦扫描显微镜SP2（德国Leica公司）；电泳仪，EC120/CSSU78（美国 Bio Rad公司）；凝胶成像系统，GIS－2019（北京天能公司）；离心机 6R（Allegra 64，Beckman－Coulter公司）；蠕动泵（MILLI PORE 公司）；酶标分析仪（THERMO Labsystens公司）。

1.3 细胞来源 HepG2肝细胞株由天津心血管研究所分子生物学实验室馈赠，本实验所用细胞株为第74代。

2 方法

2.1 HepG2细胞培养 HepG2肝细胞株在含有DMEM+10%新生小牛血清培养中，消化液采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，胰蛋白酶终浓度为0.25%，EDTA终浓度为0.05%，HepG2细胞接种于75 mL的细胞培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳（CO2）培养箱传代培养。饱和湿度，贴壁生长，待细胞长满80%瓶底，消化液消化传代。

2.2 实验分组 将HepG2细胞分为5组，正常组、丹酚酸B组、姜黄素组、荷叶碱组、何首乌碱组，每组设6个复孔。

2.3 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

2.3.1 总RNA提取及逆转录 每孔加入1mLTrizol，提取总RNA，按照试剂盒说明cDNA反转录反应条件为30℃10min，50℃30min，99℃5min，5℃5min为一个循环，完成逆转录。

2.3.2 PCR引物及反应条件 见表1。

表1 引物序列（引物由赛百盛公司合成）

反应条件：起始变性94℃5min，变性94℃30秒，退火55℃45秒，延伸72℃7 min。β－actin退火温度为64℃，其余作用条件同上。各体系均进行30个循环。

2.3.3 扩增产物分析 取5 μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳25 min，利用凝胶成像分析系统、扫描、拍照，计算目的基因RT-PCR产物吸光度容积与β-actin基因RT-PCR产物吸光度容积之比值作为mRNA相对含量。

2.4 统计方法 采用SPSS17.0软件进行统计学处理，数据用均数±标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异。

3 结果

丹酚酸B、姜黄素、荷叶碱、何首乌碱对HepG2细胞株脂代谢基因 PPARα、HL、ApoB100、ApoAⅡ和ApoCⅡmRNA的表达水平，见表2。

表2 中药单体对HepG2细胞株脂代谢相关基因表达水平的影响（s）10-6mol/L

表2 中药单体对HepG2细胞株脂代谢相关基因表达水平的影响（s）10-6mol/L

n PPARαHLApoB100ApoAⅡApoCⅡmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA空白对照 6 1.02±0.06 1.01±0.03 1.02±0.07 1.04±0.06 1.04±0.04丹酚酸 B 6 1.34±0.06 1.12±0.04 0.60±0.01 0.99±0.06 1.21±0.06姜黄素 6 1.22±0.05 0.92±0.03 0.60±0.01 1.16±0.07 0.70±0.01荷叶碱 6 1.34±0.05 1.02±0.05 1.07±0.09 1.04±0.07 0.81±0.02何首乌碱 6 0.51±0.01 0.42±0.02 0.72±0.01 1.06±0.04 1.10±0.04组别

丹酚酸B、姜黄素、荷叶碱能够刺激HepG2细胞PPARα mRNA表达水平升高，而何首乌碱可使PPARα mRNA表达下调（见图1-A）；丹酚酸B能够刺激HepG2细胞HL mRNA水平升高，姜黄素和首乌碱使HL mRNA表达水平下调（见图1-B）；荷叶碱不能刺激HepG2细胞株ApoB100 mRNA表达上调，丹酚酸B、姜黄素、首乌碱均使ApoB100 mRNA表达下调（见图1-C）；姜黄素能够刺激ApoAⅡmRNA表达上调；丹酚酸B、荷叶碱和首乌碱均不能调节ApoAⅡmRNA的表达（见图1-D）；丹酚酸B和何首乌碱可升高ApoCⅡmRNA表达水平，荷叶碱、姜黄素能够刺激HepG2细胞ApoCII mRNA表达水平下调（见图1-E）。

图1 中药单体对细胞脂代谢相关基因表达水平的影响

4 讨论

脂肪肝是由于脂质代谢紊乱造成脂肪在肝脏内沉积而出现的多种病理生理学病变，主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化，进一步发展可能形成肝硬化[1]。临床实践证明，张伯礼教授的疏肝导浊中药方治疗脂肪肝有很好的疗效。丹参总酚酸具有活血，降脂作用，可以使浊邪易于消散，而且丹参味苦性降，有下行之意，对疏肝导浊具有较好的疗效；姜黄性温，归脾、肝经。研究表明，姜黄素具有降低高脂血症大鼠血清总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白（LDL-C）的作用，对家兔动脉粥样硬化的形成亦有抑制作用。并能提高血清中的总抗氧化能力及过氧化物歧化酶（SOD）活性，从而降低血脂[4]；荷叶生物碱具有抑制高胆固醇症和动脉粥样硬化及抗有丝分裂等作用，对于降低血脂水平，调节脂质代谢具有较好的效果；何首乌既可养血益肝、固精益肾；又可润肠通便，可以减轻脂肪肝患者的乏力等症状。为进一步探讨张伯礼院士的疏肝导浊法治疗脂肪肝的作用机制，笔者采用疏肝导浊法复方中药中各味药单体丹酚酸B、姜黄素、荷叶碱和何首乌碱，分别对HepG2肝细胞株进行干预，观察这些中药单体对HepG2肝细胞株脂代谢相关基因PPARα、HL、ApoB100、ApoAⅡ及 ApoCⅡ表达的影响，进一步研究疏肝导浊方药治疗脂肪肝的作用机制[1]。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是一种同醇类激素受体，有3种亚型α，β，γ，其中的PPARα参与调节编码肝脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白CⅢ等基因的转录、活化、调节脂肪酸的摄取、结合及脂质转运等。在脂质代谢中起着重要的作用[2]。实验结果表明丹酚酸B、姜黄素、荷叶碱能够刺激HepG2细胞PPARα mRNA表达水平升高，从而促进高密度脂蛋白（HDL）的主要载脂蛋白apoAI，apoAⅡ转录表达，从而使血浆HDL升高；降低肝脏apoCⅢ的产生，增加脂蛋白酯酶的表达；伴随β氧化增加，降低甘油三酯的水平。

肝脂酶（HL）是体内一种重要的调节脂代谢的脂酶，不仅具有多种脂酶活性，而且可作为配体促进LDL和乳糜微粒（CM）残粒进入肝细胞而被清除[3]，并能直接参与高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）的逆转运和高密度脂蛋白残粒的分解代谢[4]，HL的主要功能主要与降低血脂有关，主要作用于极低密度脂蛋白（VLDL）、β-VLDL及VLDL残粒中的甘油三酯（TG）。HDL中积累的未酯化胆固醇在HL作用下由肝摄取，在HDL3转化为HDL2的过程中可防止肝外组织过量胆固醇的积累，其中HL起重要作用。实验证明，丹酚酸B能够刺激HepG2细胞HL mRNA水平升高，HL mRNA的表达增加有助于肝脏中的脂肪分解代谢，有利于肝脏中β氧化，从而降低肝脏中甘油三酯的含量。

载脂蛋白是构成血浆脂蛋白的重要组分，赋予脂类以可溶的形式，而且在血浆脂蛋白代谢中起重要作用：1）促进脂类运输。2）调节酶活性。3）引导血浆脂蛋白同细胞表面受体结合。是功能上极其活跃的一组血浆蛋白质，见表3。ApoB100是LDL受体的配体，其负责LDL在体内的清理、参与VLDL的合成与分泌、向组织运输脂类和胆固醇等，是一种重要的脂蛋白[8]。Espinosa等[9]通过转基因小鼠模型研究，认为野生型小鼠与ApoB100超表达的小鼠相比，野生型小鼠对高脂肪食物的消化和吸收能力较差、血脂水平较低。本实验中丹酚酸B、姜黄素、何首乌碱、荷叶碱均能刺激HepG2细胞株ApoB100 mRNA表达上调，ApoB100合成增加，可使肝脏中的甘油三酯形成VLDL转运出肝脏，降低肝脂。另外，ApoAⅡ是HL的激活剂，能够促进HL的活性上升，使肝脏中脂质代谢加强。姜黄素和何首乌碱能够刺激ApoAⅡmRNA表达上调。丹酚酸B和何首乌碱可升高ApoCⅡmRNA表达水平，而ApoCⅡ是LPL的激活剂,能够促进LPL的活性增加使体内脂质代谢加强。

表3 载脂蛋白及其功能

值得注意的是，不同的中药单体药效作用有差别：1）丹酚酸 B 可促进 PPARα、HL、Apo CⅡ mRNA的表达，抑制ApoB100 mRNA的表达，不能调节ApoAⅡmRNA的表达。2）姜黄素可促进PPARα、ApoAⅡ mRNA 的表达，抑制 HL、ApoB100、ApoCⅡmRNA的表达。3）荷叶碱可促进PPARα、HL mRNA的表达，抑制Apo CⅡmRNA的表达，不能调节ApoB100、ApoAⅡmRNA的表达。4）何首乌碱能够促进ApoCⅡmRNA的表达，抑制HL、PPAR、ApoB100 mRNA的表达，不能调节ApoAII mRNA的表达。

以上实验可以看出中药单体药效作用部位和机制，明确了中药单体的相对作用靶位，也同时可以比较出复方中药作用是多靶点共同作用的结果，为研究疏肝导浊方药的治疗脂肪肝提供了理论基础。

[1]J Zafrani ES.Non-alcoholic fatty liver disease，an emerging pathological spectrum[J].Progress in lipid Res,2001,40(4):269-281.

[2]Wei Wang,Torao Ishida,Toshihiro Miura,et al.Effect of Tangzhiqing on glucose and lipid metabolism in genetically type2 diabetes KKAy mice[J].Journal of health science,2008,54(2):203-206.

[3]Wang Tao,Zhang Deqin,Li Yuhong,et al.Regulation effects onabnormalglucoseandlipidmetabolismofTZQ-F,anewkind of traditional Chinese medicine[J].Journal of Ethnopharmacology,2010,128:575-582.

[4]石 晶，陶 沂，宋洪杰，等.姜黄素降血脂及抗动脉粥样硬化作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2001，14（1）：31-33.

[5]孙 龙，迟宝荣，张 填，等.过氧化物酶体增殖物激活受体-α 与肝脏疾病的关系[J].新医学，2007，38（2）：127-129.

[6]Choi SY,Goldberg U,Curtiss LK,et al.Interaction between ApoB and hepatic lipase mediates the uptake of ApoB-containing lipoproteins[J].J Biol Chem,1998,27(32):20456-20462.

[7]Fan J,Wang J,Bensadoun A,et al.Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction ofplasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,30(9):724-728.

[8]张 森，李 辉.载脂蛋白B研究进展[J].国际遗传学杂志，2006，29（5）：364－367.

[9]Espinosa-Heidmann DG，Sail J,Heman dez EP,et al.Basal laminar deposit form ation in Apo B100 transgenic mice:complex interactions between dietary fat,blue light,and vitamin E[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45:260-266.