Notch1信号系统在氟西汀上调大鼠海马神经再生中的作用☆

隋毓秀 张志珺郭怡菁孙奕

近年的研究发现Notch1及其相关蛋白在成年动物脑内海马区持续表达，表明在成熟分化的神经系统中该信号通路仍然起着作用［1］。Breunig等［2］应用原位杂交技术在体发现，Notch1的过度表达促进神经前体细胞增殖。Notch1基因敲除存在小鼠海马再生障碍，LTP下降，且可为外源性Jag-1逆转［3］。由此可见，Notch1信号系统对成年期中枢神经系统的再生有重要作用。我们前期的研究通过慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)和孤养法建立抑郁大鼠模型，发现与正常大鼠相比，抑郁大鼠海马齿状回Notch1信号通路蛋白及基因表达水平显著降低，与同一部位的神经干细胞增殖的减少并行［4］。提示Notch1信号通路有可能在抑郁大鼠神经重塑障碍发挥作用。而氟西汀促进神经再生与其抗抑郁效应相关。这些促使我们思考，慢性氟西汀干预提高神经再生是否同样伴随着Notch1信号通路的改变。为了说明这一问题，我们应用大鼠腹腔注射氟西汀建立在体模型，测定大鼠海马中BrdU阳性细胞数和Notch1信号通路各个因子的基因及蛋白表达水平的改变。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)成年雄性大鼠，体质量在220～280 g之间。腹腔注射氟西汀(Fluoxetine，Flu)建立干预模型。选择体重相近大鼠约40只，每组12只，随机分为3组:对照组、14 d Flu干预组、28 d Flu干预组。干预组给予氟西汀(常州四药)，蒸馏水配成质量浓度1 mL/mg的溶液，2 mg/kg，每日1次腹腔注射，对照组同时给予同等量生理盐水，治疗持续至14 d或28 d结束［5］。干预组和对照组大鼠每笼5只，在相同的室温、光照条件下正常喂养，给药时间为每日下午14:00。

将BrdU用生理盐水配制成5 mg/mL的溶液，在应激开始和最后1 d分别腹腔注射(3×50 mg/kg;每8 h)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化和免疫荧光检测海马齿状回神经干细胞增殖、存活和分化 BrdU注射后2 h，戊巴比妥钠深度麻醉大鼠。多聚甲醛PBS溶液灌注、固定、取脑，海马连续冰冻切片，片厚30 μm。BrdU免疫组化:小鼠抗大鼠BrdU抗体(1∶500)，生物素化的羊抗小鼠IgG(1∶500)，辣根过氧化物酶复合物(1:100)，DAB显色剂呈色，封片、镜检。BrdU/NeuN、BrdU/GFAP双标:小鼠抗大鼠 BrdU抗体(1∶200)，山羊抗小鼠 TRITC(1∶200)，兔抗 NeuN 抗体(1∶200)或兔抗 GFAP 抗体(1∶200)，山羊抗兔 FITC(1∶200)。

用Nikon CFM-500 E倒置荧光显微镜和图象分析系统进行观察与分析。采用盲法立体计数法计数海马齿状回的BrdU阳性细胞总数。每只大鼠每隔6张选取1张脑片，对海马齿状回，计数两条颗粒细胞层的内侧边界和门区的BrdU阳性细胞。在400倍和1000倍的光镜下计数，视野最边界的细胞不在计数范围内。计数每张脑切片BrdU阳性细胞数，相加后乘以6即得到每个大鼠海马齿状回的总BrdU阳性细胞数目(n=6)。免疫荧光:每只大鼠统计不少于50个BrdU阳性细胞，以双标阳性占全部BrdU细胞的比例×100来表示(n=6)。

1.2.2 Real time PCR 和 Western blot检测 Notch1 信号系统各因子基因表达和蛋白水平 应激结束后第2天断头处死大鼠，快速剥离海马，机械匀浆后置于－80℃中保存备用。用Triziol法提取总RNA，然后用逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。构建聚合酶体系(详见表1)。Taq酶(Promega)催化。热循环:95℃预热5 min，35个循环(95℃ 10 s;57℃ 15 s;72℃ 20 s;85℃5 s)。各样品目的基因和管家基因分别进行SYBR荧光实时定量聚合酶链反应，检测Notch通路相关因子基因表达水平，各实验组均取同样条件下培养的3份标本进行检测，取其平均值，结果表示为由梯度稀释DNA标准曲线得到样品目的基因校正后的相对含量(目的基因与内参比值)±标准差。

海马组织经蛋白质抽提试剂(1 mL抽提试剂中加入5 μL 蛋白酶抑制剂混合液，5 μL PMS F 和 5 μL 磷酸酶混合液)提取蛋白质。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。经变性取50 μg经20%SDS-PAGE(十二烷基硫磺胺－聚丙烯酰胺)电泳，转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)，4℃封闭过夜，用一抗(rabbit anti-NICD，Hes1，Hes5，Jag1 and Beta-actin antibody，1 ∶1000，Santa Cruz)室温孵育1 h，洗膜后加入辣根过氧化物标记的二抗(anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase，HRP，1∶5000，Santa Cruz)。ECL(增强化学发光法)显影，x光片暗室中感光，凝胶成像分析系统(上海天能仪器有限公司)进行扫描并记录光密度强度。蛋白水平结果以相对灰度值表示，即目的基因与内参(βactin)灰度测量比值。

1.3 统计学方法采用SPSS 11.5统计软件，数据均以±s表示。采用单因素方差(one-way ANOVA)分析进行显性检验，组间差异比较用Bonferroni法，检验水准 α=0.05。

表1 Notch通路各因子引物序列

2 结果

2.1 慢性氟西汀干预对大鼠海马神经干细胞增殖、存活和分化的影响

2.1.1 神经干细胞的增殖 在氟西汀干预最后一天大鼠腹腔注射BrdU，以观察氟西汀对海马神经干细胞增殖的影响。如图1所示，BrdU阳性细胞主要位于亚颗粒细胞层，呈簇状，形状不一，提示正在进行分裂的不成熟细胞［5］。结果发现，与对照组(2919.50±188.80)比较，Flu干预14 d组(3706.50±228.04)和Flu干预28 d(4334.33±217.48)组海马BrdU阳性细胞明显增加，差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.1.2 神经干细胞的存活 在氟西汀干预开始大鼠腹腔注射BrdU，以观察氟西汀对海马神经干细胞存活和分化的影响。如图2所示，BrdU阳性细胞形状较为规整，呈园形或椭圆形，且BrdU阳性细胞的绝对值较观察增殖状态时少，提示经4周生长、成熟，部分干细胞可能已凋亡，与既往研究结果一致［6］。结果发现，与对照组(2404.50±148.77)相比，Flu干预 28 d组(3273.16±156.68)BrdU阳性细胞明显增加，差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.1.3 神经干细胞的分化 神经干细胞分化成为成熟的神经元和神经胶质细胞至少需28 d，因此我们氟西汀干预开始时大鼠腹腔注射BrdU(3×50 mg/kg;每8 h)，以观察其分化情况。结果发现，与对照组(71.63±10.21)相比，Flu干预28 d组(72.41±13.34)NeuN/BrdU比例无明显差异(P＞0.05);与对照组(14.34±2.03)相比，Flu干预28 d组(18.21±2.60)GFAP/BrdU比例无明显差异(P＞0.05)。(图3)

2.2 慢性氟西汀干预对Notch1信号系统各因子基因表达和蛋白水平的影响

2.2.1 Real time PCR检测Notch1信号通路各因子基因表达 如图4所示，与对照组［NICDmRNA(0.30±0.03)，Hes1mRNA(0.53 ±0.03)，Hes5mRNA(0.21 ±0.02)，Jag1mRNA(1.04±0.07)］比较，Flu干预 14 d组［NICDmRNA(0.45±0.05)，Hes1mRNA(0.65±0.06)，Hes5mRNA(0.31 ±0.06)，Jag1mRNA(2.46 ±0.39)］和 Flu干预 28 d［NICDmRNA(0.42±0.03)，Hes1mRNA(0.85±0.06)，Hes5mRNA(0.39±0.02)，Jag1mRNA(3.21±0.34)］组Notch1信号通路各因子基因水平均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01或P ＜0.001)。

2.2.2 蛋白质印迹实验 (Western blotting)检测Notch1信号通路各因子(NICD、Hes1、Hes5、Jagged1)蛋白水平 如图5所示，与对照组［NICD(2.36±0.17)，Jag1(2.33±0.31)］比较，Flu干预 14d组［NICD(3.20±0.25)，Jag1(2.86±0.25)］和 Flu干预28 d［NICD(3.40±0.19)，Jag1(3.35±0.14)］组Notch1信号通路蛋白水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.001)。与对照组Hes5(0.89±0.20)比较，Flu干预14 d组 Hes5(0.95±0.09)和 Flu干预28 d Hes5(1.14±0.09)蛋白水平无改变，差异无统计学意义(P＞0.05)。与对照组Hes1(1.09±0.25)比较，Flu干预14 d组Hes1(1.32±0.22)蛋白水平无显著改变(P＞0.05)，Flu干预28 d Hes1(1.43±0.13)蛋白水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 慢性Flu干预对海马齿状回神经干细胞增殖的影响。A、B、C分别显示对照组、Flu干预14 d组和Flu干预28 d组海马BrdU阳性细胞(10×)

图2 慢性Flu干预对海马齿状回神经干细胞存活的影响。A、B分别显示经过28 d Flu干预后，对照组、Flu干预28d组海马的存活细胞(10×)

图3 海马齿状回神经干细胞的分化(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP双标)(20×)

图4 Real time PCR检测慢性Flu干预后Notch1信号通路各因子基因表达，与对照组比较，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001

图5 Western blot检测慢性Flu干预后Notch1信号通路各因子蛋白水平。A:蛋白表达图片，B:各因子蛋白水平;与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001

3 讨论

本实验应用BrdU观察慢性氟西汀干预对正常大鼠海马齿状回神经再生的影响。在连续给药14 d或28 d后，大鼠腹腔注射BrdU标记，行免疫组织化学染色。图1显示，氟西汀干预下海马BrdU阳性细胞进行性增加，说明慢性氟西汀干预增加神经干细胞的增殖，且随用药时间的延长，促增殖作用愈加明显。BrdU注射28 d以后，行免疫组化染色观察新生细胞的存活。结果显示，与对照组相比，Flu28 d组BrdU阳性细胞显著增加。说明慢性氟西汀具有保护神经干细胞抗凋亡的作用，增加了神经干细胞的存活。应用成熟神经元标志物NeuN或神经胶质细胞标志物GFAP，同时与BrdU免疫荧光双标显示神经干细胞的分化。结果未发现慢性氟西汀干预对神经干细胞分化的影响。以上实验结果说明，慢性(2～4周)氟西汀干预可以促进齿状回的神经发生，引起正常大鼠海马齿状回神经干细胞增殖和存活的上调，而对分化无明显影响。提示氟西汀的神经保护作用是确切的，与临床起效时间一致，而且宜长期用药以确保能全面发挥保护功效。大量实验已证实，长期(2～4周)氟西汀处理增加BrdU阳性细胞比例是通过促进细胞增殖实现的，对细胞分化没有任何影响［7－8］，本实验结果再次验证了这一现象。

氟西汀能促进成年动物脑内神经干细胞的增殖和存活，一定程度上改善应激造成的神经功能缺损［9］，但至今对其内源性神经干细胞增殖的分子机制不甚了解。本研究以慢性氟西汀干预正常大鼠作为研究对象，选择在用药后14 d和28 d两个时间点检测海马Notch通路各因子的表达，以阐明整个通路的功能状态。结果提示慢性氟西汀干预大鼠海马的Notch1信号通路呈现进行性表达变化，即干预后14 d和28 d Notch信号各因子基因表达均显著增高。提示氟西汀干预状态下Notch信号通路功能的上调。而在蛋白水平，干预后14 d和28 d仅发现NICD和Jag1的显著升高，Hes1在氟西汀干预28 d后有显著升高，Hes5无明显改变，个别因子变化的不同步性可能与蛋白表达的延迟有关。而配体和受体表达的升高仍可说明该信号通路的激活。

对Notch通路的研究显示，Notch信号具有促进神经干细胞增殖、维持和向神经胶质细胞分化的作用。NICD是Notch通路的胞内活性片段，代表信号系统的激活，该因子的表达增加强有力的提示通路功能的上调。Hes1、Hes5作为Notch信号途径的靶基因，较之其它因子(如Hes-3)，与维持神经干细胞在未分化状态的联系更为紧密。并且发现在哺乳动物大脑发育中HES-5可以作为特定标记物来区分神经干细胞与其它祖细胞［10］。因而，Hes1和Hes5的表达增加，与促进神经干细胞增殖有密切关系。研究表明，Jag1可通过作用于Notch受体和其下游效应器(信号分子Shh等)来促进神经干细胞的生存1［11－13］。Jag1的表达增加，可能通过Shh发挥其促进海马神经干细胞增殖的作用。Notch信号通路的激活促进了神经干细胞的增殖和存活，与此一致，我们在免疫组化中试验发现随氟西汀干预时间的持续，神经干细胞增殖和存活的数目进行性增加，提示Notch参与了氟西汀调节海马齿状回神经再生的上调。但本实验未发现胶质细胞分化的增多，提示还有其他调控因子参与了海马神经再生的调节。

我们的研究发现，慢性氟西汀干预下Notch1信号通路功能上调的同时，海马神经干细胞的增殖、存活增加。二者发生的一致性，结合近年来有关Notch信号通路在成年后神经再生作用的研究背景，提示Notch1信号系统可能与氟西汀干预下海马的神经重塑障碍有关。我们将在进一步的研究中检测氟西汀干预应激大鼠后Notch通路的功能状态，研究其与海马神经再生的关系，这将有助于进一步阐明抑郁状态下神经增殖、分化的基本机制，寻找到新的抗抑郁治疗的靶点。

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