小剂量MK-801对大鼠参照记忆、空间工作记忆和逆反学习能力的影响☆

李继涛 苏允爱 杨阳 冯瑜 黄润虎 司天梅

认知功能障碍是精神分裂症的核心症状之一［1］。目前精神分裂症的动物模型多利用自发活动、前脉冲抑制和社会接触等行为指标来模拟该疾病的阳性和阴性症状［2－4］，但对认知功能障碍的模拟尚处于探索阶段。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂如苯环己哌啶(phencyclidine，PCP)和氯胺酮(Ketamine)可诱导正常人产生拟精神病症状或加重精神分裂症患者的原有症状，而且已有研究发现急性或亚急性注射低剂量NMDA受体拮抗剂能够在啮齿类动物中模拟部分精神分裂症的认知缺陷［5］。因此，本文以非竞争性NMDA受体拮抗剂地卓西平马来酸盐(dizocilpine，MK-801)为工具药，利用Morris水迷宫测试系统，考察小剂量NMDA受体拮抗剂对大鼠参考记忆、空间工作记忆和逆反学习的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠61只，体重300～350 g，分三批购自北京大学医学部实验动物中心，分别用于考察参照记忆(22只)、空间工作记忆(16只)和逆反学习(23只)。每批动物均随机分为MK-801组和对照组，同笼饲养，4只/笼，自由进食与饮水。实验前大鼠在动物房饲养至少7 d，维持室温(23±1)℃，湿度45% ～55%，12 h昼夜节律(08:00～20:00)。每天行为实验前30 min将动物移入行为测试房适应环境。所有实验均在09:00～12:00完成。

1.2 药物与剂量 地卓西平马来酸盐 (dizocilpine，(+)-MK-801)购自美国 Sigma公司，溶于生理盐水。每只动物每次行为测试前20 min腹腔注射给药，给药体积为2 mL/kg，注射剂量选为0.1 mg/kg，对照组给予相同体积的生理盐水。

1.3 认知功能测试装置和训练程序

1.3.1 Morris水迷宫系统 由上海吉量软件科技有限公司生产。为塑料的圆柱形水池，直径185 cm，高45 cm，站台直径9 cm，实验前加入适量黑色墨水以更好地隐藏站台。水迷宫有4个象限，站台位置位于象限中心，站台没于水面下2 cm。水池周围有白色不透明窗帘围绕，并贴有4种不同大小、形状和颜色的标记物帮助大鼠空间定位。恒温器维持水温(23±1)℃，使用吉量视频跟踪软件分析大鼠航行轨迹。大鼠完成适应训练24 h后进行正式实验。

1.3.2 认知功能测试 采用Morris水迷宫测试大鼠的3个认知能力［6］，即①参照记忆:每天分别从4个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠寻找站台所需时间，计为逃避潜伏期。若大鼠入水90 s内找到站台，让其在站台上停留15 s;若90 s内未找到站台，由实验者引导其上台，并台上停留15 s，潜伏期按90 s计算。每次训练间隔15 s。结果分析时取每天4次训练潜伏期的均值来反映动物当天的学习能力。连续训练4 d，入水点位置不变，但顺序随机排列。第5 d撤除站台进行空间探索实验，记录大鼠60 s内在各象限的探索时间、穿越站台次数等指标。结果分析时根据四个象限的性质，将其分为目标象限(站台所在象限)、对立象限和相邻象限三类。由于相邻两象限在位置上等价，因此将两象限的相应指标平均后纳入统计;②空间工作记忆:连续训练6 d，操作同参照记忆，但每天随机更换站台位置，使后一天的训练不依赖前一天的记忆。每天做2个试次，第1个试次定义为样本试次(Sample trial)，第2个试次为匹配试次(Matching trial)，两试次间隔15 s。结果分析时，分别将每只动物6 d的样本试次或匹配试次进行平均，通过比较两试次间潜伏期的变化来反映动物的空间工作记忆能力;③逆反学习能力:包括参照记忆和逆反学习两个阶段。首先将站台固定在Ⅰ象限。每只动物连续训练学习4 d，空间探索1 d。操作同参照记忆实验，但期间不给药。目的是让每组动物均能学会将站台定位在第Ⅰ象限中央。然后进入逆反学习阶段，将站台固定在Ⅲ象限中央。动物连续训练学习4 d后，第5 d再次进行空间探索实验。本实验分析方法同参照记忆。以每只动物新目标象限与旧目标象限探索时间百分比的差值作为逆反指标来评价每只动物的逆反学习能力。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0进行统计分析。实验结果以均数±标准误表示。采用重复测量方差分析各实验逃避潜伏期随训练天数或次数的变化趋势，以组别作为组间因素，训练天数(参照记忆和逆反学习)或训练次数(空间工作记忆)作为组内因素;采用独立样本t检验比较空间探索组间差异;采用Wilcoxon配对秩和检验比较空间探索组内各象限间探索时间百分比。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 大鼠参照记忆能力的比较 定向航行实验中，双因素重复测量方差分析显示训练天数［F(3，60)=3.21，P ＜0.05］和组别［F(1，20)=377.80，P ＜0.001］对潜伏期有显著影响，两者之间无交互作用。与对照组比较，MK-801组动物训练第2～4 d潜伏期显著增加(P＜0.05)。空间探索实验中，对照组在目标象限探索时间百分比多于相邻象限和对立象限(P＜0.05)，但MK-801组在三个区域探索时间上差异无统计学意义(P＞0.05)。另外，与对照组相比，MK-801组穿越站台次数明显减少［(1.45±0.43)vs(0.18±0.12)，t=2.82，P＜0.05)］。见表1。

表1 小剂量MK-801对大鼠参照记忆潜伏期和空间探索实验的影响

2.2 大鼠空间工作记忆能力的比较 双因素重复测量方差分析显示训练试次与组别的交互作用显著［F(1，14)=484.54，P=0.03］:对照组匹配试次的潜伏期显著短于样本试次(P＜0.05)，但MK-801组动物在两试次潜伏期上无差异(P＞0.05)。见表2。

2.3 大鼠逆反学习能力的比较 参照记忆阶段未进行药物注射。训练结果发现两组动物在每天平均逃避潜伏期、空间探索时间差异无统计学意义(P＞0.05)。逆反学习阶段进行药物注射后，双因素重复测量方差分析显示训练天数(F(1，21)=3605.18，P＜0.01)和组别［F(1，21)=6.64，P＜0.05］对潜伏期有显著影响，两者之间无交互作用。见图1。与对照组比较，MK-801组第2～3 d逃避潜伏期延长(P＜0.05)。空间探索实验中，MK-801组在当前目标象限和原目标象限探索时间的差异无统计学意义(P＞0.05);以每只动物新目标象限与旧目标象限探索时间百分比的差值作为逆反指标来评价每只动物的逆反学习能力，与对照组比较MK-801组动物逆反学习成绩显著下降(t=3.08，P＜0.01)。见表3。

3 讨论

精神分裂症患者存在长时记忆、工作记忆、推理与问题解决能力等多个维度认知功能的障碍［1］，这些认知功能障碍严重程度与其生活质量的改善密切相关［7］。因此，建立精神分裂症认知障碍的动物模型对于揭示该疾病的发病机制及评估药物疗效有着十分重要的临床意义。啮齿类动物腹腔注射NMDA受体拮抗剂MK-801建立精神分裂症动物模型是目前公认的精神分裂症药理模型之一。我们前期研究发现急性注射MK-801可显著增加小鼠的自发活动和刻板行为［2］以及引起前脉冲抑制的缺失［3］，模拟了精神分裂症患者的阳性症状及感觉门控功能缺失等。本研究进一步发现，MK-801可显著破坏大鼠长时记忆、空间工作记忆和策略转换能力，在一定程度上模拟了精神分裂症的认知障碍。

表2 小剂量MK-801对大鼠空间工作记忆的影响

图1 小剂量MK-801对大鼠逆反学习实验中定位航行实验的影响。1)与对照组比较，经重复测量方差分析及简单主效应分析，P＜0.05

表3 小剂量MK-801对大鼠逆反学习空间探索实验的影响(%)

参照记忆反映了经重复训练后动物对站台位置的学习和记忆形成。本研究发现MK-801组动物逃避潜伏期显著长于对照组，而且对目标象限的探索与其它象限没有差异，提示腹腔注射小剂量MK-801破坏了大鼠的学习记忆能力，这与 Stuchlik等［8］和 Enomoto等［9］的研究结果一致。海马的完整性对参照记忆十分重要。脑室注射NMDA受体拮抗剂AP5可破坏大鼠水迷宫定位航行的学习能力［10］，这主要是因为NMDA受体阻断剂可破坏海马长时程增强(LTP)的形成，而LTP被认为是学习记忆的生理基础。临床研究发现精神分裂症患者在虚拟迷宫任务中潜伏期延长，而且在目标象限探索时间较对照组显著减少［11］。这进一步验证了应用Morris水迷宫任务模拟精神分裂症患者认知障碍的可行性。

与反复训练所形成的长时记忆不同，空间工作记忆实验反映了对信息的短时存储能力和操作能力。Dudchenko将啮齿类动物实验中工作记忆定义为“在一次训练期间对所用到的物体、刺激或位置信息的短时记忆”［12］。在本实验中，动物需依赖样本试次中掌握的站台位置信息来完成匹配试次找站台的任务;而且站台位置信息不影响第二天的训练，因为站台位置每天均不同。结果表明，MK-801组潜伏期在两个试次上无显著差异，说明MK-801破坏了动物对信息的暂时存储能力。既往有研究者利用n-back任务［13］和T型水迷宫［14］均发现0.1 mg/kg MK-801对大鼠的工作记忆有显著的破坏作用，本研究结果与其一致。由于Morris水迷宫的工作记忆涉及到空间信息，因此该任务可能由前额叶－海马环路来介导。Yoon等［15］通过注射GABA-A受体激动剂蝇覃醇使内侧前额叶或背侧海马暂时失活，均可导致大鼠空间工作记忆破坏;提示大鼠空间工作记忆依赖多个脑区的共同参与，神经网络连接比较复杂。

在逆反学习任务中，动物需要抑制已经掌握的策略以学习新的策略，因此该任务反映了反应抑制和行为灵活性，即随外界环境变化而转化策略的能力。精神分裂症患者在Wisconsin卡片分类任务上往往表现为对已掌握策略的保持性错误而无法转换策略完成当前任务［16］。由于考察逆反学习的前提是动物已习得某种能力，而本研究中参照记忆的结果表明小剂量MK-801会导致动物无法习得站台的空间位置，因此本研究中单独购买了一批动物来保证两组动物在进行逆反学习前的基线水平一致。研究结果表明，MK-801组在逆反学习阶段潜伏期延长，而且空间探索任务上似乎无法区分新旧两目标象限。本研究与Chadman等［17］发现急性腹腔注射MK-801 0.1mg/kg引起Long-Evans大鼠在T迷宫内的逆反学习损伤一致。脑区损毁研究表明，逆反学习能力与前额叶－纹状体皮层的功能完整性密切相关［17］，提示MK-801可能通过引起该神经环路的异常而发挥作用。

既往研究提示，急性腹腔注射过高剂量(≥0.2 mg/kg)的MK-801可引起大鼠运动系统功能异常，使动物出现自发活动增多，刻板行为明显以及共济失调［8］，从而干扰认知任务的完成，因此本实验中MK-801的注射剂量为0.1 mg/kg。根据我们以前的实验，急性注射0.1 mg/kg MK-801对SD大鼠的自发活动并无影响，而且本文的三个实验中，MK-801组和对照组在游泳速度上也无差异。这与以往研究一致［9］，说明注射0.1 mg/kg MK-801引起的认知破坏是特异性的，并没有混淆运动系统功能异常这一因素。总体而言，本研究结果表明，大鼠注射小剂量MK-801可以作为一种可能的精神分裂症认知障碍模型，且通过一种给药方式和一套设备能够从长时记忆、工作记忆和策略转换等不同认知维度去模拟精神分裂症患者的认知缺陷，具有很强的实用性。

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