亚综合征抑郁B细胞淋巴瘤白血病-2基因表达研究

李则挚 张晨 洪武 苑成梅 易正辉 汪作为 吴志国 黄佳 禹顺英 方贻儒

亚综合征抑郁(Subsyndromal Symptomatic Depression，SSD)是一种可影响个体心理社会功能的亚临床的阈下抑郁状态［1］，发病率为3.9%～12.3%。研究提示，SSD可能是抑郁疾病谱系中的一个亚型，可向抑郁症发展［2－4］。SSD个体的一级亲属的抑郁障碍、酒依赖风险增加，提示SSD与抑郁症可能存在某些共同的遗传学基础［5］。然而目前对于SSD的病因遗传学研究尚缺乏。为探讨SSD的可能致病基因，本课题组前期通过全基因组外周血基因表达谱芯片分析，显示B细胞淋巴瘤白血病-2(B-cell lymphoma Leukemia-2，Bcl-2)基因在 SSD 中表达下降［6］。本研究应用实时定量逆转录－聚合酶链反应法(RT-qPCR)，进一步验证亚综合征抑郁症患者Bcl-2基因外周血的差异表达，以初步探讨Bcl-2在亚综合征抑郁症病理生理机制中的作用。

1 对象和方法

1.1 研究对象 来自2007年12月至2009年4月期间于上海市心理咨询中心门诊就诊的亚综合征抑郁的咨询者。纳入标准:①同时满足美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM-Ⅳ)诊断标准中的2个或2个以上但少于5条的抑郁症状，大部分或全部时间存在;②病程至少2周;③罹患者社会功能受损，但不符合轻性抑郁(Minor Depressive Disorder，MinDD)、复发性短暂性抑郁(Recurrent Brief Depression，RBD)和心境恶劣障碍(Dysthmic Disorder，DD)的诊断标准［1］;④年龄 18 ～60 岁;⑤汉族;⑥患者或家属签署知情同意书;⑦汉密尔顿抑郁量表17项(Hamilton Depression Rating Scale 17，HAMD17)＜17分;⑧未服用过任何抗抑郁药及抗精神病药物。排除标准:①DSM-Ⅳ其他精神疾病;②脑器质性疾病、较严重的心脑血管疾病及肝肾等重大疾病史;③妊娠期及产后1年。共入组64例，男12例，女52例;年龄19～53岁，平均(35.42±5.18)岁;病程0.5～9.0个月，中位数5.2个月;HAMD17评分(13.89±1.72)分。

正常对照组:来自我院及其他医院的职工及家属、研究生和进修医生。年龄l8～60岁;汉族;HAMD17评分＜7分;排除既往及访谈时存在的各类精神疾病、脑器质性疾病、较严重的心脑血管疾病及肝肾功能等重大疾病史、物质滥用等及精神疾病家族史。共入组64名，男12名，女52名;年龄l8～60岁，平均(35.87±8.91)岁。患者组和对照组之间年龄差异无统计学意义(t=1.28，P ＞0.05)。

该研究通过上海交通大学医学院附属精神卫生中心伦理委员会批准，所有受试者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料评估 采用DSM-Ⅳ-TR轴Ⅰ障碍定式临床检查患者版(Structured Clinical Interview for DSM-IV-TR Axis I Disorders-Patient Edition，SCID-I/P)［7］进行入组访谈，符合入组标准者采用HAMD17评定临床症状。量表评定者为2名高年资医生，一致性检验的Kappa值为0.87。

1.2.2 总RNA的提取及逆转录合成cDNA 晨空腹抽取肘静脉血5mL(抽血前1天忌食高油脂食物)，2%的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝;应用总RNA提取试剂盒(Trizol Reagent)(Invitrogen Inc，Carlsbad，CA)2 h内提取外周血总RNA;使用752紫外光栅分光光度计测定每个样本中总RNA的纯度，1.8＜260nm波长的紫外光下吸光度/280nm波长的紫外光下吸光度(OD260/OD280)＜2.0，RNA浓度5×10－7～8×10－7g/L，保存于 －80 ℃冰箱备用。使用逆转录试剂盒(Omniscript Reverse Transcription Reagents)(Qiagen，Chatsworth CA)和随机引物(Promega CA)合成第1链cDNA，同时使用RNA酶抑制剂(TOYOBO，Japan)防止RNA降解。

1.2.3 荧光实时定量逆转录－聚合酶链反应 使用TaqMan MGB探针法在384孔ABI Prism 7900序列检测系统(Applied Biosystems，CA)上进行荧光实时定量PCR扩增，分析Bcl-2基因表达水平。为控制不同样本间的基因表达水平的差异，使用管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen-ase，GAPDH)作为内对照基因来标化目的基因的表达水平(以GAPDH作为内对照基因，计算Bcl-2基因mRNA相对定量即2－ΔCT)。每个样本的Bcl-2基因和内对照GAPDH基因均重复3次。管家基因及Bcl-2基因均于美国ABI公司定制(定制探针的序列号分别为GAPDH:Hs99999905_ml，Bcl-2:Hs0008023_ml)，每个荧光实时定量 PCR扩增体系共10 μL:TaqMan Universal PCR Mastermix 4.0 μL，TaqMan MGB Probe+Primer 0.4 μL，RNase-free H2O 5.35 μL，cDNA 模板 0.25 μL。荧光实时定量PCR扩增条件:50℃ ×2 min→95℃ ×10 min，95℃ ×15 s，59℃×1 min，50个循环。采用比较循环数(Cycle threshold，CT)的方法进行相对定量［6］，使用软件SDS version 2.2软件进行数据处理。荧光定量PCR的结果以CT值显示，CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，CT值越大，表达量越低。每个样本的ΔCT值=单样本平均目标基因CT值－单样本平均GAPDH基因CT值。每个样本的2－ΔCT代表目的基因的表达水平。以正常对照组的平均ΔCT值为标准计算出每个患者组的2－ΔΔCT(每个患者组的ΔΔCT=每个患者组的平均ΔCT－正常对照组的平均ΔCT)来计算表达差异的倍数［6］。

1.2.4 统计学处理 使用SPSS 17.0进行统计分析。2组样本的年龄的比较采用t检验;2组Bcl-2基因各样本表达量2－ΔCT的比较使用独立样本t检验;将Bcl-2基因相对表达量与HAMD17评分进行Pearson相关分析。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 Bcl-2基因mRNA相对表达水平 SSD组Bcl-2基因mRNA相对表达水平为(0.34±0.11)，低于正常对照组(0.41±0.13)，差异有统计学意义(t=4.43，P＜0.01)。SSD组BDNF基因mRNA表达水平比正常对照组降低17.63%(图1)。

2.2 HAMD17评分与Bcl-2基因mRNA表达水平的相关分析

SSD组BDNF基因mRNA表达水平(2－ΔCT)与患者HAMD17评分的相关无统计学意义(r=－0.22，P＞0.05)。

图1 亚综合征抑郁组与正常对照相比较Bcl-2基因表达量的差异倍数。注:以2－ΔΔCt来计算差异倍数.ΔΔCt为每个患者的平均ΔCt值分别减去所有正常对照的平均值.柱形代表基因表达的差异倍数.以正常对照相比较(fold change=1)，Bcl-2的基因表达量下降了17.63%

3 讨论

DSM-Ⅳ分类系统中阈下抑郁包括轻性抑郁、复发性短暂性抑郁和恶劣心境，但临床上仍有1/3～3/4的阈下抑郁患者不符合上述诊断，但却同样会造成罹患个体严重的社会功能损害［1］。SSD由Judd等［1］于1994年提出并定义如下:患者同时有2个或2个以上的抑郁症状，大部分或全部时间存在，但少于抑郁症诊断标准的5条，病程≥2周，罹患者社会功能受损，却并不符合轻型抑郁、重症抑郁或恶劣心境的诊断标准，是一种未被重视或未被发觉但具有相当重要性的阈下抑郁状态，对罹患者的社会功能造成严重影响。

本研究在既往研究基础上，进一步从外周血mRNA差异表达水平对SSD与Bcl-2基因的关系进行验证。结果显示，亚综合征抑郁患者外周血Bcl-2基因表达显著低于健康对照，进一步验证了之前基因芯片研究的结果，提示Bcl-2表达量的下降在SSD的病理生理机制中可能起到重要作用。既往研究显示，Bcl-2基因在抑郁样行为及抑郁症的病理生理机制中起着重要的作用［8］。Chiou等［9］的研究显示抗抑郁药物吗氯贝胺能使Bcl-2的表达上调，同时诱导神经元干细胞向五羟色胺神经元分化。Ou等［10］研究也显示，单胺氧化酶抑制剂能使Bcl-2表达上调，对神经元凋亡有抑制作用。Peng等［11］从小鼠的海马组织中合成神经元干细胞，经三环类抗抑郁剂米帕明处理后，Bcl-2的mRNA和蛋白水平显著升高。本研究与既往对于抑郁症的研究结果相一致，间接提示了SSD与抑郁症可能有着共同的遗传学基础，进一步为SSD是抑郁疾病谱中的一个过渡阶段或亚型这一假说提供了间接证据。

但是到目前为止，Bcl-2与抑郁谱系障碍相关的机制尚不清楚。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，它能维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布，并通过阻断线粒体膜通透性转运孔(Permeability transition pore，PTP)异常开放，抑制线粒体细胞色素C和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated x protein，Bax)的释放，拮抗caspase-3的激活，并调节细胞氧化还原状态，抑制氧化应激，减少氧自由基(reactive oxygn species，ROS)的产生，从而抑制细胞的凋亡，在神经细胞抗凋亡中起着重要的作用。有可能正是Bcl-2的这种抗凋亡作用参与了抑郁样行为或抑郁症的病理生理机制。因为已有不少研究经发现，神经元的凋亡在抑郁样行为或抑郁症的发生中起着重要的作用［12］。另一方面，Bcl-2还是丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路细胞内信号转导过程中的重要的基因，而目前已经很明确MAPK通路在细胞生长、发育、分化及细胞的可塑性和重构中起着重要的作用，而这些作用又已经被证明了与抑郁样行为或抑郁症的病理机制密切相关［13］。

本研究没有发现Bcl-2外周血的表达量与SSD的HAMD17评分相关，不能证明其在外周血的表达量的多少反应SSD的症状严重程度，也许是样本量还相对偏少，又或许是HAMD17量表本身就不适合SSD人群的评定。这一点还有待进一步研究。

值得指出的是，之前我们的研究还验证了SSD患者中BDNF基因表达水平也较正常组低［6］。已有研究证实BDNF的MAPK通路的级联反应中，Bcl-2的减少可以阻断MAPK通路的信号转导，反过来BDNF的下降也会减少CREB的转运调控，从而也会减少加Bcl-2的合成［11］。所以从这一点来看，SSD的产生也许不仅仅是单个基因的功能障碍，而是BDNF/MAPK/Bcl-2通路整体的一种功能障碍，这一点还有待进一步进行验证。

由于活体脑组织取材困难，所以本研究只是对外周血白细胞的基因表达水平研究，不能直接反应脑组织内的基因表达情况。随着近年来转化医学的兴起，对人类疾病的新参数－生物标志物的研究越来越受到重视，外周的生物标志物在一定程度上反应了机体中枢的情况。最近Rollins等［14］的研究也发现，外周血白细胞的基因表达水平与中枢组织基因表达成显著正相关。然而就本研究发现的这种外周血Bcl-2表达水平的变化，是引起疾病的原因，还是疾病所产生的现象，这还有待于进一步进行确证。

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