组织蛋白酶D酶原和转铁蛋白受体在人脑胶质瘤中的表达☆

周金桥 孙剑瑞 宋来君 刘宇

胶质瘤发生发展的分子机制尚未完全阐明。组织蛋白酶D酶原(procathepsin D，pCD)是组织蛋白酶D的前体形式，由392个氨基酸组成的分子量为52kD的无活性的蛋白酶原，与肿瘤细胞的浸润、转移密切相关［1］。转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)是分子量为90kD的II型跨膜糖蛋白，是细胞摄取铁及细胞生长调节所必需的蛋白之一。增殖旺盛的细胞TfR表达水平通常上调，而且肿瘤细胞的TfR表达更进一步增高［2］。本研究采用免疫组织化学和RT-PCR方法检测pCD、TfR蛋白和mRNA在胶质瘤中的表达并探讨两者的临床意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2008年至2009年郑州大学第一附属医院神经外科胶质瘤标本52例，其中男27例，女25例，年龄12～68岁，平均(42±20)岁。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类标准(2007年)［3］，I-II级23例(脉络丛乳头状瘤3例，毛细胞型星形细胞瘤5例，纤维型星形细胞瘤4例，原浆型星形细胞瘤6例，少突胶质细胞瘤5例)，III-Ⅳ级29例(胶质母细胞瘤7例，间变性星形细胞瘤4例，间变性少突胶质瘤6例，髓母细胞瘤7例，胶质肉瘤5例)。另收集对照非瘤脑组织12例(取自颅脑损伤患者内减压术)，所有标本均经病理医师确诊。

1.2 免疫组织化学方法(ABC法)石蜡切片脱蜡，梯度酒精至水，EDTA法抗原修复液(pH 9.0)微波处理30 min，室温冷却，3 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶，1∶50的正常马血清室温孵育20 min。加1∶200的pCD 山羊多抗(Merck，IM04L)和1∶40的TfR(Novocastra，C 10F11)鼠一抗置于湿盒内，4℃冰箱孵育过夜(12 h)。分别加1∶200的生物素标记的抗山羊和抗鼠二抗，孵育45 min，ABC(1∶1∶50)室温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)和H2O2孵育，显微镜下观察，适时终止反应，最后苏木素复染15～30 s和封片。阳性对照采用已知阳性切片，以PBS代替一抗做为阴性对照。染色阳性表现为细胞膜和/或胞浆成呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，400倍显微镜下随机选取5个视野，每个高倍视野数取100个细胞，计数100个细胞中染色阳性细胞数，阳性细胞数＜25%为(－)，25% ～为(+)，50% ～为(++)，75% ～100%为(+++)。

1.3 逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)应用Trizon(康为)提取手术组织总RNA，并测定RNA的A260/A280值均在1.6～1.8之间。pCD上游引物5'TCACAGTCGTCTTCGACACG 3'，下游引物5'TTTCACCTCT CCGTCCAGAAA 3';TfR上游引物5'CGT GAT CAA CAT TTT GTT AAGATT C 3'，下游引物 5'CCA CAT AAC CCC CAG GATTCT 3'。内参β-actin上游引物 5 CCACATAACCCCCAG GATTCT 3'，下游引物 5'TTCCAGTTTTTAAATCC TGAGTC 3'。反转录采用SuperRT Reverse Transcriptase试剂盒，反应总体积为 25 μL，包含 2 μg RNA，0.5 mmol/L dNTPs，0.025 μg/μL oligo dT，5 μmol/L MgCl2，0.01 mol/L DTT，2 U/μL 的RNaseOUT TM抑制剂和2.5 U/μL的SSII RT。

1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0进行χ2检验或t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 pCD在胶质瘤及非瘤对照组织中的表达 pCD阳性免疫反应主要分布于细胞膜和细胞浆，呈淡黄色至深浅不同的棕黄色颗粒(图1 A)。在正常的脑组织，仅见极少量的神经细胞膜轻度黄染，正常的胶质细胞染色阴性;在Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤细胞的胞浆和胞膜有少量黄染的颗粒，根据阳性细胞数，pCD呈阳性表达(+);在III-Ⅳ级胶质瘤细胞的胞浆中散在分布大量的棕黄色颗粒，pCD呈中度(++)至强阳性(+++)表达。统计分析表明:与非胶质瘤组织相比，I-II级胶质瘤中pCD的表达明显增高(χ2=2.873，P＜0.05);III-Ⅳ级胶质瘤分别与I-II级胶质瘤、非瘤组织比较，pCD表达显著增高(χ2=13.965，P＜0.05)。见表1。

2.2 TfR在胶质瘤及非瘤对照组织中的表达 TfR阳性免疫反应主要分布于细胞膜和细胞浆，呈淡黄色至深浅不同的棕黄色颗粒，强阳性表达者也可弥散至细胞核(图1 B)。在正常的脑组织的神经细胞膜轻度黄染，呈弱阳性表达;在Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤细胞的胞浆和胞膜有中等程度的黄染颗粒，染色细胞数也较正常的脑组织多，呈中度阳性表达;在III-Ⅳ级胶质瘤细胞的胞膜、胞浆甚至在细胞核中弥漫性分布大量的棕黄色颗粒，少数细胞TfR也表达于细胞核，呈强阳性表达。统计学分析表明，TfR在III-Ⅳ级胶质瘤中表达显著上调(χ2=6.589，P＜0.05)。见表1。

2.3 RT-PCR结果胶质瘤组织中pCD和TfR mRNA的表达高于非瘤组织(t=8.871，t=4.568，P ＜0.05)。见图2。

图1 pCD和TfR在胶质瘤中的表达。A:pCD在III-Ⅳ级胶质瘤中的强阳性表达ABC(×200);B:TfR在III-Ⅳ胶质瘤中的阳性表达

表1 非脑瘤及不同级别胶质瘤组织pCD和TfR的表达

图2 pCD和TfR mRNA在胶质瘤中的表达及其半量分析。A:pCD mRNA在III-Ⅳ级胶质瘤中的强阳性表达(t=8.871，P＜0.01);B:TfR mRNA在III-Ⅳ胶质瘤中的阳性表达(t=4.568，P＜0.05)。T表示胶质瘤组织;N表示非瘤对照组织

3 讨论

组织蛋白酶D酶原(pCD)在溶酶体内低PH值作用下，它的激活肽段被切除后形成由双链组成的成熟CD［4］。过度表达的组织蛋白酶D以pCD非激活形式被分泌到胞外，获得自分泌丝裂原的能力，参与细胞外基质降解和恶性疾病的转移扩散，促进癌细胞的生长［5］。研究表明:位于pCD氨基端的激活肽段具有有丝分裂原活性，通过与细胞表达未知受体结合后发挥与生长因子类似的活性［6］;体外和体内pCD的转染可促进瘤细胞的生长，瘤体的生长体积和速度与pCD的表达水平一致［7］。实验表明pCD在一些恶性肿瘤组织中高表达，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等，并且与乳腺癌转移的危险性呈高度相关性［6，8］，这些研究提示pCD的高表达与肿瘤的高危转移、极差预后呈正相关。

对于以浸润生长为主要生物学特征的胶质细胞瘤pCD的表达情况，我们的研究结果表明:pCD在脑星形胶质细胞瘤的表达是与肿瘤恶性程度有关，正常脑组织仅表达极少量的pCD，在Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤的异常细胞内，呈阳性表达，在III-Ⅳ级胶质瘤样本中，pCD的表达水平升高(P＜0.05);不同级别之间差异具有统计学意义。同时，我们发现在III-Ⅳ的样本中，pCD阳性细胞的数目也显示出差异，高度恶性Ⅳ级胶质瘤的阳性细胞数目多，认为pCD对脑胶质细胞瘤的浸润性生长起重要作用。因此我们认为，pCD表达量越多，越有利于胶质瘤细胞侵袭性生长，pCD的表达失调可能是胶质瘤发生转化过程中的重要分子事件，标志着胶质瘤细胞获得了侵袭能力，促进肿瘤的浸润和转移。

转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)是细胞摄取铁及细胞生长调节所必需的蛋白之一。TfR是细胞增殖所必需的，增殖旺盛的细胞通常TfR表达水平上调，肿瘤细胞的TfR表达更进一步增高，故长期以来是理想的治疗靶点［9］。有研究表明铁代谢失调与细胞的恶性转化相关，如乳腺、肝、结肠、膀胱、肺等，而且TfR的表达增加还与肿瘤的分化程度和肿瘤的分级、分期、预后有关［10］。近年来，应用杂交瘤技术已建立了针对TfR治疗性抗体，并在体内、外的抗瘤研究中取得了良好的效果［11］。有学者还利用噬菌体展示技术筛选出了特异的抗TfR人单链可变区抗体片段(anti-TfR scFv)，与传统的单克隆抗体比较，anti-TfR scFv表现出更强效的细胞毒性［12］。这些实验都进一步表明增殖旺盛的细胞TfR表达水平通常上调，而且增殖旺盛肿瘤细胞的TfR表达更进一步增高，侵袭能力强，与肿瘤的浸润及转移密切相关。

本实验结果显示III-Ⅳ级胶质瘤的TfR表达异常增高明显高于Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤和正常脑组织(P＜0.05)，而非瘤脑组织和Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤细胞的表达差异并不显著;可能因为正常脑组织组织细胞及恶性度低、侵袭能力低的肿瘤组织细胞中也有着相似的TfR表达，故在Ⅰ-Ⅱ胶质瘤和正常脑组织中TfR的表达没有统计学上的差异。可见胶质瘤恶性程度越高，TfR表达量越多。TfR的高表达可以导致胶质瘤细胞增殖旺盛，侵袭能力增强，对胶质瘤的转移有极大的促进作用。

为探讨pCD和TfR在胶质瘤中高表达的分子机制，本实验采用RT-PCR技术对胶质瘤和非癌脑组织中pCD和TfR的mRNA转录水平进行了比较分析，结果也显示胶质瘤组织中pCD和TfR mRNA表达水平显著增高，表明pCD和TfR不仅在蛋白水平存在差异表达，转录水平的mRNA也存在着差异表达，二者在胶质瘤组织与非瘤组织中的蛋白表达差异性表达可能是由于转录水平调控所引起。

pCD和TfR在星形胶质细胞瘤的侵袭性生长过程中发挥了重要的作用，它们可能加速了病变的进展，使瘤细胞的浸袭、转移能力更强，患者的预后更差，不仅可作为临床评价胶质瘤恶性程度和侵袭性的分子标志，判断患者的预后，而且pCD和TfR还可能作为胶质瘤治疗中非常有潜力的分子治疗靶点。

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