鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析*

刘 巍,孔义波,张兴晓,柴同杰*

(1.山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;2.山东省动物用生物制剂工程技术中心,山东烟台 264003)

鸡传染性支气管炎病毒0801株的分离鉴定及S1基因序列分析*

刘 巍1,孔义波2,张兴晓2,柴同杰1*

(1.山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;2.山东省动物用生物制剂工程技术中心,山东烟台 264003)

2008年1月,河北沧州某产蛋鸡场鸡群出现呼吸道症状,少数鸡只出现死亡,剖检发现鸡只肾脏肿大,呈“花斑肾”样,收集患病鸡只肾脏、气管等组织,进行病毒分离培养。经新城疫病毒干扰试验、血凝试验、动物回归试验、鸡胚交叉中和试验及分子生物学鉴定,证实分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,并命名为0801;鸡胚交叉中和试验结果表明,0801株与疫苗Ma5株中和指数最高,为同一血清亚型;对其S1基因进行克隆、序列测定与分析,表明0801株的S1基因全长1 620 bp,核苷酸序列与Massachusetts型疫苗株相似性在75%左右,氨基酸牙似性亦在75%左右。

传染性支气管炎病毒;交叉中和试验;S1基因;序列分析

*通讯作者

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性高度接触性传染病。该病毒主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统和泌尿生殖系统,可以引起雏鸡死亡,蛋鸡产蛋量及蛋品质下降,给养禽业造成巨大的经济损失[1-3]。IBV突出的特点是血清型众多,且新的血清型和变异株不断出现,给本病的防治带来很大困难,免疫失败现象时有发生[4]。所以,从现地分离株中筛选疫苗株对控制IB非常重要。

IBV的基因组为不分节段的单股正链RNA,编码3种主要结构蛋白(纤突蛋白S,膜蛋白M和核衣壳蛋白N)及其他蛋白。IBV的S蛋白可以裂解成S1和S2两个亚单位。S1是重要的免疫原蛋白,能诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体,并且与病毒的组织嗜性有关。S1基因的点突变、插入、缺失或者重组是IBV产生新血清型,亚型和变异株的主要原因[5-6],对于S1基因的变异与病毒的抗原性的改变之间是否存在一致性尚不清楚。故对S1基因深入研究具有重要意义。本试验从分子水平研究0801株S1基因的分子结构和遗传进化特点,通过鸡胚交叉中和试验分析其血清型,为新疫苗研发筛选新毒株,并为IB的防控提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病料采自河北沧州某产蛋鸡场;传支疫苗株H120、H52 、M41 、W93、Ma5、新城疫病毒 LaSota株、受体菌DH5α株由本实验室保存;Trizol试剂购自invitrogen公司;RT-PCR相关试剂及克隆用载体等材料购自宝生物工程(大连)有限公司;其他常规试剂为国产分析纯;IBV S1基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,根据Gen Bank已发表的鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列,委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成两对引物,用于S1基因全序列扩增。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 采集病死鸡肾脏、气管等组织,剪碎,按1∶5比例加入灭菌生理盐水,匀浆,冻融3次,8 000 r/min离心5 min,上清液0.45 μ m 滤器过滤除菌。经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,0.2 mL/枚,37℃孵育,收集24 h～96 h鸡胚尿囊液,观察鸡胚有无肉眼可见的病变,盲传3代,置-70℃保存,并命名为0801株。

1.2.2 病毒鉴定

1.2.2.1 新城疫病毒干扰试验 10日龄SPF鸡胚三组。第1组通过尿囊腔接种0801株鸡胚尿囊液0.1mL/枚,第2组接种无菌生理盐水作为对照。37℃孵育10 h后,两组同时经尿囊腔复种NDV 0.1 mL/枚(La Sota株的鸡胚尿囊液)。第3组为生理盐水对照。37℃孵育48 h后,4℃过夜,无菌收集尿囊液,常规测定NDV血凝效价。

1.2.2.2 致鸡胚矮小化试验 将0801株鸡胚尿囊液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚,0.1 mL/枚,同时设生理盐水对照组,37℃孵育144 h,弃去24 h内死亡鸡胚,观察鸡胚发育及病变情况并称量体重。

1.2.2.3 血凝试验 0801株尿囊液经8 000 r/min,离心5 min弃沉淀,上清分两份,其中一份经胰酶37℃震荡作用2 h(胰酶终浓度为10 mg/mL),另一份不做任何处理,作为对照。常规微量法测定尿囊液红细胞凝集价,每个样品重复两次。

1.2.2.4 动物回归试验 15日龄SPF雏鸡10羽,随机分成2组,每组5羽,分笼隔离饲养。第一组经点眼滴鼻方式接种0801株的鸡胚尿囊液0.3 mL;第二组为对照组,相同途径接种等量的灭菌生理盐水。每日观察记录鸡只临床病理表现。

1.2.3 鸡胚交叉中和试验

1.2.3.1 传支代表毒株鸡胚半数感染量(EID50)测定 用无菌生理盐水将 0801、H120、H52、W93、M41和Ma5株鸡胚尿囊液10倍梯度稀释,每个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚,0.1 mL/胚,37℃继续孵育,观察统计24 h～144 h胚体发育及病变情况,根据Reed-Muench二氏法计算EID50值。

1.2.3.2 传支代表毒株抗血清制备 0801、H120、H52、W93、M41和Ma5株分别免疫健康雄兔 3次后,心脏采血,分离血清,分别制得抗血清,置-70℃保存备用。

1.2.3.3 交叉中和试验 采用固定病毒稀释血清法,将 0801、M41、H120 、H52、W93 和 Ma5 分别稀释至200 EID50/0.1 mL,分别与传支代表株0801、M41、H120、H52、W93 和 Ma5不同稀释度的抗血清进行交叉中和试验。各稀释度血清与病毒等量混合,37℃水浴感作1 h,经尿囊腔接种SPF鸡胚0.1 mL/枚,每个稀释度接种5枚,同时设置阴性兔血清对照、病毒对照和生理盐水对照,观察统计24 h～144 h胚体发育及病变情况,观察记录结果。

1.2.4 S1基因克隆及序列分析 Trizol法提取病毒总RNA,利用RT-PCR方法,扩增分离株S1基因,PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后,连入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定,应用DNAStar软件对测序片段进行拼接,并与GenBank中参考毒株(表1)S1基因进行同源性比较和序列分析。

表1 参考毒株及其GenBank登录号Table 1 IBV strains included in the phylogenetic analysis of the S1 gene in this study

2 结果

2.1 新城疫病毒干扰试验

血凝试验结果显示,试验组比对照组的血凝价降低了2个～3个滴度(表2),表明分离株0801具有干扰新城疫病毒LaSota株增殖的特性。

表2 新城疫干扰试验Table 2 The result of 0801 strain interference with NDV-LaSota

2.2 致鸡胚矮小化试验

0801株经SPF鸡胚传代后可引起鸡胚发育迟缓,与正常鸡胚相比,鸡胚体重减轻(表3)。鸡胚病变明显,蜷缩成紧实的球形,羊膜增厚,紧贴胚体,卵黄囊收缩,尿囊液明显增多。

表3 致鸡胚矮小化试验Table 3 T he result of short stature caused by 0801 straina

2.3 血凝试验

采用常规方法对0801株进行红细胞凝集试验,结果显示,未经任何处理的病毒尿囊液对10 g/L鸡红细胞无直接血凝活性,而经10 g/L胰蛋白酶处理后对鸡红细胞具有血凝活性,HA滴度为1∶512。

2.4 动物回归试验

SPF雏鸡在攻毒后第3天均出现甩鼻现象,拉白色稀粪,采食下降,饮欲增加,至第6天出现死亡现象,10 d后共死亡2只。死亡鸡剖检可见肾脏肿大,有白色尿酸盐沉积,呈“花斑肾”样(图1),其他脏器无明显病变。对照组未见任何症状。

图1 0801株引起的肾脏病变Fig.1 Kidney lesions that IBV 0801 strain produced

2.5 鸡胚交叉中和试验

根据公式R=(r1×r2)1/2×100%计算鸡胚交叉中和试验相关系数,交叉中和试验结果(表4)显示,0801 株与Ma5、W93、H120 、M41、H52株的关系系数 R 分别为 80.7%、67.7%、73.3%、54.0%、70.8%。依据判定标准(R＞80%,两毒株为同一亚型;25%＜R＜80%,两毒株为同一血清型的不同亚型;R＜25%,两毒株为不同的血清型),判定0801株与疫苗株 Ma5、W93、H120、M41、H52 株均为同一血清型,其中与疫苗株Ma5株为同一血清型的同一亚型。

2.6 S1基因的克隆及序列分析

PCR产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,分别可见约1 596 bp和762 bp左右的片段,与预期大小相符。将PCR扩增得到的两个基因片段进行胶回收后连入pMD18-T载体,转化DH5α大肠埃希菌感受态细胞,经筛选将阳性重组质粒进行序列测定,拼接测序结果,得到0801株S1基因序列全长为1 620 bp(GenBank登录号为HQ398360)。与已发表参考株序列对比显示,0801株与当前普遍应用的Massachusetts型疫苗株 H120、H52、Ma5、M41及国内疫苗株W93株核苷酸同源性约为75%,推导氨基酸序列对比结果显示同源性亦约为75%。同时与Gen-Bank 注册的 Arkansas、Conn、Gray、793/B 等血清型同源性差异亦在20%以上。而GenBank BLAST对比结果显示0801株S1基因与国内分离株LC2、WF株S1基因同源性最高,其核苷酸同源性高达99%,氨基酸同源性亦接近99%。序列分析结果显示0801株S蛋白裂解位点序列为RRFRR,符合传支毒株裂解位点序列(图2和图3)。

表4 0801株与5株疫苗株鸡胚交叉中和试验结果Table 4 T he result of chicken embryos cross-neutralization between 0801 and other 5 IBV strains

图2 IBV 0801株S1基因与参考株的进化树Fig.2 Phylogenetie tree of IBV nucleotide of S1 gene of 0801 and other reference strains

图3 IBV 0801株S1基因氨基酸序列与参考株同源性比较Fig.3 Comparison of S1 gene of IBV 0801 strain with other strains

3 讨论

对本试验分离到的0801株,通过新城疫病毒干扰试验、致鸡胚矮小化试验、血凝特性试验、动物回归试验及分子生物学试验等证实0801分离株为一株传染性支气管炎病毒。动物回归试验表明0801株具有较强的毒力。

S1蛋白是IBV主要免疫原蛋白,在刺激机体产生保护性抗体方面起着决定性作用[7]。S1蛋白易于发生变异,并直接影响着IBV的血清型、致病性和抗原性。通过鸡胚交叉中和试验鉴定0801株的血清型[8-9],结合S1基因的序列分析,结果表明虽0801株与Massachusetts型疫苗株核苷酸及氨基酸同源性较低,但0801分离株属于Massachusetts血清型,与Ma5为同一血清亚型,与Massachusetts型疫苗株 H120、H52 、M41 、Ma5、W93 为同一血清型的不同亚型。表明IBV的血清中和抗原与S1基因的同源性之间不能完全吻合。

本研究中对0801株S1基因进行了序列测定,并与国内外已发表参考株S1基因进行了比较分析,结果表明,0801株S1基因与国内分离株 LC2、WF株S1基因相似性最高,与常用Massachusetts型疫苗株相似性较低,与GenBank中注册的Arkansas、Conn、Gray、793/B等血清型相似性差异亦在20%以上。表明传染性支气管炎病毒在我国已存在较大程度等变异。系统进化树显示,很多中国分离株已独立成支,且在国外鉴定分离进化分支中亦可以找到中国分离株的影子,说明了中国IBV病原的复杂多样[10-11]。同时,对参考株S1基因裂解位点[12-13]的分析,中国分离株中囊括了所有 RRFRR、RRSRR、HRRRR、RRIRR、RRYRR、RRH RR 6种裂解位点,而国外分离株仅有RRF/SRR两种,虽无证据表明S基因裂解位点与血清型、致病性及宿主细胞嗜性方面有密切相关性,但中国分离株的复杂多样可见一斑。S1基因N端前180位氨基酸为高变区,其变异程度较大,与参考株序列对比分析发现部分分离株高变区第23、24位及127、128、129位氨基酸缺失,则71位～78位氨基酸存在插入,而0801株不符合此缺失与插入。这些位点的缺失和插入与病毒抗原性之间的联系仍需进一步研究。

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Isolation and Sequence Analysis of S1 Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus 0801 strain

LIU Wei1,KONG Yi-bo2,ZHANG Xing-xiao2,CHAI Tong-jie1*

(1.Acdemic of Animal Science,Shandong Agriculture University,Tai＇an,Shandong,271018,China;2.Shandong Provincial Animal Biological Agents ERC,Yantai,Shandong,264003,China)

In the January of 2008,respiratory signs were observed in the chicks of a layer farm in Cangzhou,Hebei province.Necropsy of the dead chicks revealed that the kindey was swollen and distended with uric acid crystals.Kidneys and tracheas were collected for virus isolation.An IBV virus was identified by viral interference test,HA test,animal regressive research,cross-neutralization and RT-PCR.The virus was designated 0801 strain.The date of cross-neutralization indicated that the 0801 strain and Ma5 vaccine strain belong to the same serotype.The S1 gene of 0801 strain was amplified,cloned,sequenced and analyzed.T he results showed that S1 gene was composed of 1620 nucleotides,homologies of nucleotide and amino acid sequences of S1 gene between 0801 strain and Massachusetts-type vaccine strains was both about 75%.

Infectious bronchitis virus;cross-neutralization;S1 gene;sequence analysis

S852.659.6;Q789

A

1007-5038(2011)08-0001-06

2011-01-25

国家自然科学基金项目(31072189)

刘 巍(1985-),女,河北保定人,硕士研究生,主要从事动物病毒学研究。