马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞bcl-2和bax mRNA表达的影响

方文娟， 余璐尧， 李大鹏， 黄金活， 吕俊华*

（1.无限极（中国）有限公司，广东广州510665；2.暨南大学药学院药理教研室广东广州510632；3.广州市中医医院，广东广州 510130）

马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞bcl-2和bax mRNA表达的影响

方文娟1， 余璐尧2， 李大鹏3， 黄金活3， 吕俊华2*

（1.无限极（中国）有限公司，广东广州510665；2.暨南大学药学院药理教研室广东广州510632；3.广州市中医医院，广东广州 510130）

目的 探讨马红丸（马钱子、红娘子、全蝎等）含药血清对人肝癌smmc-7721细胞bcl-2和bax mRNA表达的影响。方法 采用血清药理学方法制备马红丸（MHP）和阿霉素（ADM）含药血清以及对照血清，作用于smmc-7721细胞。MTT法检测含药血清对smmc-7721细胞增殖的影响；测定含药血清对smmc-7721细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放量；流式细胞术检测细胞凋亡率；RT-PCR检测含药血清对smmc-7721细胞bcl-2mRNA和bax mRNA表达的影响。结果 30%体积的马红丸和阿霉素含药血清作用于smmc-7721细胞72 h，明显抑制细胞的增殖（P＜0.01），培养液中LDH的释放量和细胞凋亡率明显高于空白血清组（P＜0.01），bcl-2 mRNA表达下降，bax mRNA表达升高（P＜0.01）。结论 30%马红丸含药血清作用于人肝癌smmc-7721细胞72 h，可明显抑制细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞中bcl-2 mRNA表达，促进bax mRNA表达有关。

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马红丸；血清药理学；人肝癌smmc-7721细胞；凋亡

原发性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）的发病率和死亡率一直位居恶性肿瘤的前位，对人类健康危害极大，也是国内外医药学界研究的重点之一［1］。马红丸是以马钱子（Semen strychni）、红娘子（Huechys sanguinea）、全蝎（Scorpio）、川足（Scolopendra subspinipes）、守宫（Gekko japonicus Dumeril et Bibron）、生甘草（Glycyrrhizae Radix）、糯米粉等组成的用于治疗肿瘤的纯中药复方制剂，临床上对原发性肝癌、胃癌等多种肿瘤具有良好的疗效［2-3］。为了探讨马红丸抑制肿瘤的可能作用机制，利用含药血清的制备方法［4］制备马红丸含药血清，培养人肝癌smmc-7721细胞，探讨马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞的抑瘤作用以及对bcl-2和bax mRNA表达的影响。

1 实验材料

1.1 动物 健康清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量为200 g左右。由广东省实验动物中心提供。许可证号为：SCXK（粤）2008-0002。

1.2 细胞 人肝癌smmc-7721细胞，购于中山大学动物实验中心细胞库。

1.3 主要仪器与药品

1.3.1 主要仪器 荧光显微镜（日本Olympus公司），Tecan Safire2型全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），NANODROP 1000 spectrophotometer（美国Thermo公司），FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），Minicycle（美国 Bio-Rad，MJ Rearch公司），DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（英国SynGene公司）。

1.3.2 药品 马红丸：丸剂，广州市中医医院院内制剂；阿霉素（注射用盐酸多柔比星）：粉针剂，浙江海正药业股份有限公司，批号081004A。

1.4 试剂 四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Sigma公司），乳酸脱氢酶（LDH）检测测定试剂盒（20090316）（南京建成生物工程研究所），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（090713）（南京凯基生物科技发展有限公司），琼脂糖粉（法国Biowest公司），M-MLV反转录试剂盒（美国Promega公司），Trizol细胞裂解液（1382739），bax、bcl-2及 GAPDH引物（美国invitrogen公司），2×Taq PCR Green Mix（西安舟鼎国生物技术有限责任公司），Nucleic Acid Stain，100bp DNA Ladder II，DTT，DEPC 水（北京普博欣生物技术有限责任公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 smmc-7721细胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，于37°C、5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，2～3 d传代。取对数生长期的细胞进行实验。

2.2 含药血清的制备［4］健康清洁级SD大鼠随机分为空白对照组、马红丸组及阿霉素组，马红丸组给药剂量为22.75 g/kg，阿霉素组给药剂量为1.27 mg/kg，空白对照组给予等体积生理盐水。每天2次，每次间隔12 h，连续3 d，给药前4 h禁食不禁水。末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，室温下静置4 h，3 000 r/min离心15 min分离血清，经56 °C、30 min 灭活处理后，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，分装于2 mL EP管中，置-20°C保存备用。

2.3 MTT法 以2×104/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，细胞继续生长24～36 h后，用体积分数分别为10%、20%、30%的空白血清，马红丸和阿霉素含药血清作用于细胞，以正常条件培养的细胞做为对照，每组4个复孔。含药血清分别作用细胞24、48、72 h后，吸去旧培养基，换以新鲜无血清培养基90 μL，并加入5 g/L 的 MTT 10 μL，继续孵育4 h。4 h后弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，待蓝紫色结晶充分溶解，于570 nm波长处用酶标仪测定各孔吸光度值。

2.4 LDH测定 用30%空白血清，马红丸和阿霉素含药血清作用于细胞后，去培养液上清，按试剂盒说明书操作。

2.5 细胞流式法测定细胞凋亡 以4×104/mL的密度接种于6孔板中，每孔2 mL，细胞继续生长24～36 h后，用30%空白血清、马红丸和阿霉素含药血清作用于细胞，以正常条件培养的细胞做为对照。收集细胞培养液，PBS洗涤细胞一次，用0.25%的胰酶消化细胞。将消化下来的细胞加入收集的细胞培养液中，混匀，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μL binding buffer，重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，再加入5 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10 min。1 h内上流式细胞仪检测。Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

2.6 RT-PCR法 以4×104/mL的密度接种于6孔板中，每孔2 mL，让细胞生长24～36 h后，用30%空白血清，马红丸和阿霉素含药血清作用于细胞，以正常条件培养的细胞做为对照。（1）Trizol法提取细胞内总RNA；（2）测定RNA浓度：从提取的RNA中取出2 μL，于NANODROP 1000型微量分光光度计上测定280 nm及260 nm处的吸光度；（3）逆转录：按promega公司提供的试剂盒说明书加入各组分，采用10 μL逆转录反应体系，于PCR仪上70 °C，孵育5 min后，再42 °C孵育1 h，放 -20 °C保存备用；（4）PCR过程：按顺序加入各组分，采用25 μL反应体系，于PCR仪上进行扩增。反应参数如下：bcl-2 94 °C 5 min；94 °C 45 s，64 °C 45 s，72 °C 2 min，循环35次；72 °C 7 min；bax及GAPDH：94°C 7 min；94 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 45 s，循环 35 次；72 °C 10 min。bcl-2 引物：上游5＇-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3＇，下游 5＇-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3＇，扩增产物 318bp；bax引物：上游-5＇-TCCACCAAGAAGCTG AGCGAG-3 ＇，下 游 5 ＇-GTCCAGCCCATGATGGCCT-3＇，扩增产物 257bp；GAPDH引物：上游 5＇-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3＇，下游5＇-TCCAGGGGTCTACTCCTG-3＇，扩增产物 512bp；（5）扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，用Bio-Rad Quantity One软件对电泳条带进行扫描和光密度分析。

3 实验结果

3.1 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞增殖的影响

30 %马红丸含药血清及阿霉素含药血清作用于smmc-7721细胞24 h和72h时，与空白血清组比较，明显抑制细胞增殖的作用 （P＜0.01），以72h抑瘤作用更为明显，故后续实验均以72 h作为抑瘤时间。见表1。

表1 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞增殖的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of Mahong Pill containing serum on the proliferation of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=6）

表1 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞增殖的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of Mahong Pill containing serum on the proliferation of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=6）

与空白血清组比较，##P＜0.01；与24 h抑制率比较＊＊P＜0.01。##P＜0.01 vs blank serum group；＊＊P＜0.01 vs 24 h group.

组别24 h OD 抑制率/%48 h OD 抑制率/%72 h OD 抑制率/%空白血清组0.77±0.05 - 1.48±0.04 - 1.92±0.03 -马红丸组 0.68±0.02 11.69±2.99 1.18±0.02## 20.27±3.38＊＊ 1.43±0.02## 25.52±1.76＊＊阿霉素组 0.62±0.03 19.48±4.76 1.02±0.06## 31.08±4.65＊＊ 1.19±0.05## 32.28±2.82＊＊

3.2 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞LDH释放量的影响

30 %空白对照组与正常组细胞培养液上清中LDH量差异无统计学意义（P＞0.05），而30%马红丸含药血清及阿霉素含药血清组细胞培养液上清中的LDH量明显升高，与30%空白血清组比较具有显著差异（P＜0.01）。见图1。

3.3 马红丸含药血清对smmc-7721细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测可见正常对照组细胞及空白对照组细胞的凋亡率分别为4.7%和5.5%，两组细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。30%马红丸含药血清和阿霉素含药血清组的凋亡率分别为23.6%和26.8%，与空白血清组比较具有明显差异（P＜0.01）。见图2。

3.4 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞bcl-2和bax mRNA表达的影响

30 %空白血清组细胞与正常对照组bcl-2/GAP-DH，bax/GAPDH和bax/bcl-2比值无明显差异（P＞0.05）；30%马红丸含药血清及阿霉素含药血清处理smmc-7721细胞后，bcl-2 mRNA表达降低，bax mRNA表达增加，bax/bcl-2比值具有明显差异 （P＜0.01）。见图3和表2。

图1 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞LDH释放量的影响（±s，n=3）与空白对照组比较，＊＊P＜0.01。Fig.1 Influence of Mahong Pill containing serum on the lactate dehydrogenase（LDH）leakage of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

图2 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞凋亡的影响（±s，n=3）与空白对照组比较，＊＊P＜0.01。Fig.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the apoptotic rate of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

4 讨论

肿瘤的发生与细胞增殖分化异常及其凋亡受抑制有关，肿瘤组织内细胞存活与凋亡的平衡失调，存活大于凋亡，则肿瘤细胞数目增加［5］。因此，促进肿瘤细胞凋亡是肿瘤防治的重要手段。凋亡是细胞在基因调控下的主动死亡形式，调控凋亡的基因可分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因两类。Bcl-2是有抑制凋亡作用的基因，Bax的作用与Bcl-2相反。下调Bcl-2或上调Bax可促进多种因素诱导的多种肿瘤细胞凋亡［6-7］。本实验采用血清药理学的方法，观察了马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞增殖的抑制作用和促细胞凋亡以及对bcl-2和bax的影响。结果表明，马红丸含药血清具有良好的抑制人肝癌smmc-7721细胞增殖作用，促进细胞LDH外漏，并在一定浓度范围内，呈剂量依赖性促进smmc-7721细胞凋亡。同时可见，马红丸含药血清处理后，可诱导smmc-7721细胞凋亡促进基因Bax表达，减少凋亡抑制基因Bcl-2的表达，Bax与Bcl-2比值升高，从而促进肿瘤细胞凋亡。

图3 马红丸含药血清对bcl-2和bax mRNA表达的影响M.marker 1.正常对照 2.空白对照 3.马红丸 4.阿霉素Fig.3 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2 and bax mRNA in human hepatoma smmc-7721cellsM.marker 1.normal control 2.blank serum control 3.Mahong Pill 4.adriamycin

表2 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞bcl-2/GAPDH和bax/GAPDH的影响（±s，n=3）Tab.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2/GAPDH and bax/GADPH in human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）

表2 马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞bcl-2/GAPDH和bax/GAPDH的影响（±s，n=3）Tab.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2/GAPDH and bax/GADPH in human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）

与空白对照组比较，＊＊P＜0.01。＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

组别 bcl-2/GAPDH bax/GAPDH bax/bcl-2比值正常对照组0.87±0.02 0.59±0.04 0.67±0.03空白对照组 0.85±0.04 0.60±0.01 0.65±0.05马红丸组 0.56±0.03＊＊ 0.99±0.03＊＊ 1.88±0.07＊＊阿霉素组 0.47±0.01＊＊ 1.22±0.10＊＊ 2.58±0.06＊＊

综上所述，马红丸含药血清对人肝癌smmc-7721细胞增殖具有抑制和促凋亡作用，其作用机理与减少凋亡抑制基因Bcl-2表达，上调Bax表达，诱导肿瘤细胞凋亡有关。

［1］Batty G D，Barzi F，Huxley R.Obesity and liver cancer mortality in Asia：The Asia Pacific Cohort Studies Collaboration［J］.Cancer Epidemiol，2009，33：469-472.

［2］汤振邦.并用马红丸治疗恶性肿瘤的疗效观察［J］.现代中西医结合杂志，2000，9（1）：54-55.

［3］嵇玉峰，李金昌，梁洪江，等.马红丸对肝癌大鼠血管形成的影响［J］.实用心脑肺血管病杂志，2009，17（4）：281-282.

［4］李仪奎，吴健宇.血清药理实验中采血时间的通法方案［J］.中国药理学通报，1999，15（6）：569-570.

［5］杨全会，许荣焜.细胞凋亡与肿瘤［J］.生理科学进展，2006，37（4）：373-378.

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［7］吕俊华，沈文娟，韦笑梅，等.荔枝核提取物对荷瘤小鼠肿瘤细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响［J］.中成药，2008，30（9）：1381-1383.

Effect of Mahong Pill containing serum on the expression of bax and bcl-2 mRNA of human hepatoma smmc-7721 cells

FANG Wen-juan1， YU Lu-yao2， LI Da-peng3， HUANG Jin-huo3， LÜ Jun-hua2
（1.Infinitus（China）Co.，Ltd，Guangzhou 510665，China；2.School of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632，China；3.Guangzhou Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou 510130，China）

Mahong Pill；serologic pharmacology；human hepatoma smmc-7721 cells；apoptosis

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1141-05

2010-06-02

方文娟（1980—），女，硕士，工程师，从事肿瘤药理学研究。Tel：（020）81107220，E-mail：wenjuan-fang@infinitus.com.cn

*通信作者：吕俊华（1954—），男，教授。Tel：（020）85223764，E-mail：yaolilv@163.com