反相高效液相色谱法同时测定仙灵骨葆滴丸中淫羊藿苷和补骨脂素及异补骨脂素的含量

钱南萍， 万维香， 魏润新

(江苏泰州市人民医院，江苏泰州 225300)

仙灵骨葆能显著提高腰椎骨密度，对中老年和绝经期患者以及骨折、骨坏死、骨关节炎等骨病有良好的疗效和安全性［1］。仙灵骨葆滴丸是由淫羊藿、补骨脂、川续断等多味中药组成，具有滋补肝肾，接骨续筋的功效，用于骨质疏松症，骨折，骨关节炎，骨无菌性坏死等。处方中主药淫羊藿作为传统的补肾壮阳中药，因其独特的化学成分和显著的生物活性一直是国内外研究的热点之一［2］，而补骨脂素及异补骨脂素亦是补骨脂中的主要活性成分。目前文献对仙灵骨葆质量的控制主要是分别检测淫羊藿苷的含量或补骨脂素及异补骨脂素［3-5］，为有效地控制产品质量，本实验采用高效液相色谱法同时测定仙灵骨葆滴丸中淫羊藿苷和补骨脂素及异补骨脂素的含量，方法简便可行，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters HPLC系统(1525泵、2487紫外可见光光度检测器、Empower色谱工作站)。

1.2 试药 仙灵骨葆滴丸(江苏清江药业有限公司，批号:20070104、20070106、20070108);淫羊藿苷对照品(批号0737-200111);补骨脂素对照品(批号0730-200309)、异补骨脂素对照品(批号0738－200108)均为中国药品生物制品检定所提供;甲醇为色谱纯(Merck KgaA，Germany);冰醋酸(分析纯，南京化学试剂厂);超纯水:自制。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流动相:甲醇-1.5%冰醋酸水溶液(55∶45);检测波长:246 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:10 μL;柱温:30 ℃。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL含淫羊藿苷 836.8 μg、补骨脂素 97.28 μg、异补骨脂素75.52 μg的混合溶液，摇匀，以此作为对照品贮备液。精密吸取上述对照品贮备液1 mL，加甲醇稀释至4 mL，摇匀，制成对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备 精密称取仙灵骨葆滴丸1.010 9 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水(50∶50)的溶液10 mL，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用上述溶液补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 精密称取缺淫羊藿和补骨脂的阴性滴丸0.999 6 g，按样品溶液的制备方法制成阴性溶液即得。

2.3 系统适用性试验 取对照品混合溶液、样品溶液和阴性样品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样10 μL测定，结果表明，在此色谱条件下，淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素分离良好，阴性样品对测定无干扰，结果见图1。

2.4 线性关系实验 精密吸取对照品溶液0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，分别置于 2 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件，依次进样10 μL，测定峰面积，将所得峰面积与进样量进行线性回归，得淫羊藿回归方程为Y=1 610 060.305X+50 445.034(r=0.999 7);补骨脂素回归方程为Y=9 997.497X+32 817.220(r=0.999 7);异补骨脂素回归方程为Y=11 049.64X+15 105.56(r=0.999 6)。结果表明，淫羊藿苷进样量在0.523～4.184 μg范围内、补骨脂素进样量在60.8～486.4 ng范围内、异补骨脂素进样量在47.2～377.6 ng范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取淫羊藿苷(209.2 μg/mL)、补骨脂素(24.32 μg/mL)、异补骨脂素(18.88 μg/mL)对照品混合溶液，重复进样6次，每次10 μL，结果，淫羊藿苷峰面积平均值为3 435 974，RSD为1.09%;补骨脂素峰面积平均值为2 466 573，RSD为0.34%;异补骨脂素峰面积平均值为2 094 161，RSD为0.53%。试验表明，该法精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批号样品6份，按2.2.2项下方法制备样品溶液，进行测定，结果淫羊藿苷含量RSD为1.4%;补骨脂素含量RSD为2.04%;异补骨脂素含量RSD为1.82%，表明方法重现性良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液10 μL，在0、2、4、6、8、12 h 分别进样，记录峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积RSD为1.12%;补骨脂素峰面积RSD为1.64%;异补骨脂素峰面积RSD为1.10%，表明样品溶液中淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素在12 h内稳定。

2.8 加样回收试验 精密称取6份已知含量的仙灵骨葆细粉适量(约0.4 g)，置锥形瓶中，分别精密加入一定量的淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液，挥干溶剂后，加甲醇-水(50:50)10 mL，精密称定，密塞，超声提取1 h，放冷，精密称定，再用甲醇-水(50:50)补足减失重量，用微孔滤膜滤过，精密吸取续滤液按2.1项下色谱条件，分别进样10 μL测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)Tab.1 Results of recovery test(n=6)

2.9 样品测定 取3批样品，按2.2.2项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 流动相的选择 本实验参考有关文献［6-7］，分别选择不同比例的甲醇-1.5%冰醋酸溶液为流动相，均可使处方中3种成分较好的分离，但实验结果表明，采用甲醇-1.5%冰醋酸溶液(55:45)为流动相，3种成分的分离效果和峰形较理想。

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab.2 Content determination of samples(n=3)

3.2 提取条件的选择 试验过程中对供试品溶液的处理方法进行了考察，通过分别采用甲醇、甲醇-水的不同比例超声提取，并对不同提取时间进行比较试验，实验中将样品分别超声0.5、1、1.5 h后测定淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素的含量，结果表明，用甲醇-水(50:50)，超声1 h处理样品为最佳，可使样品中的淫羊藿苷、补骨脂素与异补骨脂素提取完全，并能很好地避免滴丸中其他成分的干扰。

3.3 测定波长的选择 经紫外扫描得知淫羊藿苷的最大吸收波长是270 nm，而补骨脂素和异补骨脂素的最大吸收波长是246 nm，文献报道［8-11］为分别采用246，270 nm进行测定的，根据实验结果，表明采用246 nm同时测定3种成分时的响应值和峰形均优于采用270 nm测定结果。本实验建立的HPLC法，通过对色谱条件的优化，可以同时测定仙灵骨葆滴丸中3种有效成分含量，方法操作简便，灵敏度高，结果准确，可作为该品种实际生产中质量控制的标准。

［1］唐卡毅.仙灵骨葆防治骨质疏松症的研究进展［J］.重庆医学，2009，38(12):1535-1537.

［2］张维波.仙灵骨葆胶囊治疗骨质疏松性压缩性骨折32例疗效观察［J］.中国医疗前沿，2009，14(13):56.

［3］周春燕，王正俊，严晓星.仙灵骨葆颗粒的质量标准研究［J］.安徽医学，2008，12(1):16-18.

［4］刘永刚，赵保胜，王秀丽，等.HPLC法测定仙灵骨葆分散片中淫羊藿苷的含量［J］.中国实验方剂学，2009，15(9):6-7.

［5］李振国，李忠保，王海波.HPLC法测定仙灵骨葆颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量［J］.中医研究，2009，25(1):25-26.

［6］苏红艳.HPLC法测定妇宁康胶囊中淫羊藿苷含量［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10(4):134-135.

［7］张壮丽，刘 力，徐德生.高效液相色谱法测定补肾益气颗粒中补骨脂素和异补骨脂素含量［J］.时珍国医国药，2007，18(2):373-374.

［8］阮桂平.HPLC测定仙珍骨宝胶囊中淫羊藿苷的含量［J］.中成药，2008，30(4):附 10-11.

［9］钟镜金，黄晓其，龙彦纲，等.高效液相色谱法测定骨康口服液中补骨脂素和异补骨脂素的含量［J］.时珍国医国药，2008，19(2):453-454.

［10］伍 庆，周 宁，冯泽熹，等.HPLC测定仙灵骨葆胶囊中淫羊藿苷和淫羊藿定C含量［J］.中成药，2009，31(8):1211-1213.

［11］刘丽华，高淑丽，孙宇红，等.HPLC法测定仙灵骨葆颗粒中淫羊藿苷的含量［J］.河北医药，2008，31(15):2002-2003.