小飞蓬总黄酮提取工艺优选及体外抗氧化活性研究

赵 爽， 严铭铭， 赵大庆， 黄耀玲， 唐 灿

(长春中医药大学，吉林长春 130117)

小飞蓬Erigeron canadensisL.为菊科植物小飞蓬Erigeron canadensisL.的干燥全草［1］。有文献记载小飞蓬的药用有清热利湿、散瘀消肿、改善肾的微循环的功效［2］并且还具有较强抗肿瘤的药理作用［2］。本课题组已从该中药材中分离出近二十余种黄酮类化合物，主要为:芦丁、槲皮素、木犀草素、芹菜素、5，7，4′－三羟基－3′－甲氧基黄酮、圣草酚、4′－羟基黄芩素－7－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、4′－羟基黄芩素－7－O－β－D－吡喃葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物［3］。在进一步对小飞蓬总黄酮提取物进行研究发现，小飞蓬黄酮类化合物除了具有文献报道的药理作用以外，还具有较强的抗氧化活性，在抗老化，抗突变，调血脂等方面具有一定的临床应用价值。

本试验以优选小飞蓬总黄酮最佳乙醇提取工艺为目标，采用正交实验法，以总黄酮和槲皮素的含量为指标对乙醇提取工艺进行比较，确立了最佳提取工艺，并对其体外自由基的清除作用进行了初步研究，为小飞蓬的利用和综合开发提供参考。

1 实验材料

UV－1700型分光光度计(日本岛津公司);Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);METTLER－AE240型电子分析天平(瑞士METTLER公司);BUCHI旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)。

芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，编号:111520－200201)、槲皮素对照品 (中国药品生物制品检定所，编号0721－200010)，二者纯度都达到98%以上，供含量测定用。1，1 二苯基苦味苯肼(1.1－dipbenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)、维生素C(Vit C)对照品、维生素E(Vit E)对照品均购于sigma公司;大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂);色谱级甲醇购于美国Fisher公司，其余试剂均为分析纯，均购于(北京精细化学品有限责任公司)。

小飞蓬采于吉林省长白县，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为菊科飞蓬属植物小飞蓬Erigeron canadensisL.。

2 实验方法

2.1 总黄酮含量测定方法［4］

2.1.1 对照品溶液的制备:精密称取5.38 mg芦丁对照品于25 mL量瓶，70%乙醇溶解并定容，配制成浓度为0.209 mg/mL的芦丁标准溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制:分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL芦丁对照品溶液于10 mL量瓶中，加70%乙醇至5 mL，依次加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，之后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，最后用70%乙醇稀释定容，摇匀，放置15 min，进行全波长扫描，结果均在510 nm处有最大吸收峰。在510 nm处测定不同浓度下的吸光度值作标准曲线。得芦丁浓度Y与吸光度A关系曲线回归方程式:Y=11.604X－0.011 3，相关系数:r=0.999 5，表明芦丁在0.010 8～0.064 6 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线形关系。

2.1.3 样品溶液的制备:分别称取小飞蓬粗粉500 g按表4正交实验表中的条件进行乙醇回流提取，合并滤液，过滤，滤液蒸干，即得小飞蓬总黄酮提取物。精密称取上述按正交表制备的相应总黄酮提取物50 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加70%乙醇定容至5 mL，照2.1.2项下自加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL起，在510 nm下测定其吸光度，带入标准曲线计算其总黄酮浓度。

2.2 槲皮素含量测定方法［5］

2.2.1 色谱条件:色谱柱:Agilent Zorbax SB－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:甲醇 －0.5%磷酸(47 ∶53)，流速:1.0 mL/min;检测波长为360 nm;柱温:30℃;理论塔板数按槲皮素计应不低于4 000。

2.2.2 对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品溶液6.5 mg置100 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.065 mg/mL的槲皮素对照品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制:精密吸取上述对照品溶液8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，18.0 μL 注入高效液相色谱仪中。按照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的进样量为横坐标，绘制标准曲线，得槲皮素的标准曲线为:Y=1 081X+16.062，r=0.999 9。表明槲皮素进样量在0.52～1.17 μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4 样品溶液的制备:称取上述按正交表制备的相应总黄酮提取物5 g，加乙酸乙酯回流提取3次，每次500 mL，合并3次乙酸乙酯提取液，减压蒸馏回收，提取物蒸干，加甲醇30 mL溶解，拌样于5 g聚酰胺(100～200目)，收集95%乙醇洗脱液，60℃水浴蒸干，加甲醇10 mL，超声，过滤，滤液蒸干，加甲醇溶解，转至10 mL量瓶中，甲醇定容，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。分别精密称取对照品溶液与样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定槲皮素含量。

2.3 DPPH溶液的配制及测定方法

在装有2 mL浓度为132.0 μg/mL的DPPH70%乙醇溶液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液2 mL摇匀，避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度Ai。用70%乙醇溶液代替样品溶液，得吸光度A0。70%乙醇代替DPPH，得吸光度Aj详见文献［6］。

清除率=1－［(Ai－Aj)/A0］×100%

式中，A0为2 mL DPPH70%乙醇溶液和2 mL70%乙醇溶液的吸光度;Ai为2 mL的DPPH70%乙醇溶液和2 mL样品的吸光度;Aj为2 mL70%乙醇溶液和2 mL样品的吸光度。

3 结果与分析

3.1 单因素对提取率的影响研究

3.1.1 提取次数的影响 分别称取小飞蓬500 g，设定提取4次，每次提取1.0 h，料液比1∶10，70%乙醇加热回流提取。计算每次提取总黄酮含量在4次总黄酮含量总和中所占的比例。结果见表1。

从表1中可以看出第1次提取总黄酮含量占总含量53%，达到了总体含量一半以上，第2次提取总黄酮含量达到42%占总黄酮含量很高的比例，第3次提取和第4次提取总黄酮含量只达到4%和1%占总黄酮总量很小比例，为了考虑节约成本，提高效率，则取消第3次和第4次提取次数。

表1 提取次数对总黄酮含量的影响(n=2)

3.1.2 提取时间的影响 提取时间过短，有效成分提取不完全，提取时间过长，费时且成本较高。根据实验预试并参照文献报道，提取时间选择1.0 h、1.5 h、2.0 h提取效果较好。

3.1.3 料液比的影响 加醇量太少，不能完全浸没药材，有效成分提取不完全，加醇量太大，成本较高。根据预试结果，加醇量为8倍、10倍、12倍较为合理。

3.1.4 醇浓度的影响 由于小飞蓬除了含有脂溶性成分外，且含有水溶性成分，为了将有效成分提取完全，以芦丁含量为指标，选取乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%，对醇提浓度进行了优选预示试验，结果见表2，从表2中可以看出，当乙醇浓为70%时小飞蓬总黄酮的含量较高，故得出醇提浓度最佳范围为65%～75%。

表2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响(n=2)

3.2 小飞蓬有效部位提取工艺的优化

单因素实验说明，提取次数为2次时，提取的小飞蓬总黄酮的量已达到其总量的95%以上，为适合工业化生产，节省能源，选取提取次数为2次，在此基础上，对乙醇浓度、提取时间及料液比进行进一步的优选，采用L9(34)正交试验表进行实验，因素水平见表3，正交试验结果见表4、表5。

表3 因素水平表

以小飞蓬总黄酮含量为考察指标时，方差分析表明:因素C和因素A对总黄酮的影响最大，因素B对结果有影响，直观分析表明:最佳提取工艺为A2B1C2;以槲皮素含量为考察指标时，方差分析表明:因素B对槲皮素提取的影响最大，因素A对其有影响，而因素C对结果无影响，直观分析表明:最佳提取工艺为A2B1C3。综合上述两个考察指标的方差及直观分析，可以看出因素A与B优选的结果一致，因素C对总黄酮提取影响较大，而对槲皮素提取无影响，为有效地将总黄酮提取出来，制定A2B1C2作为最佳提取方案，即70%乙醇、料液比1∶10、每次1.0 h。

3.3 验证实验

称取小飞蓬药材3批，按正交实验优选结果进行提取并测定其含量。结果见表6。

3.4 体外抗氧化实验

DPPH自由基清除 DPPH自由基是判定药物体外抗氧化活性的经典实验方法，并利用维生素E能抑制脂溶性抗氧化物和维生素C能抑制水溶性抗氧化物的特点综合评定小飞蓬总黄酮的抗氧化活性。以正交优选工艺制备的小飞蓬总黄酮样品A及在此优选工艺上进一步纯化的小飞蓬总黄酮精制品B及精制品C进行了自由基的清除能力实验，并与相应浓度的维生素C和维生素E作为对照，结果见表7。

表4正交试验设计结果(n=2)

表5正交实验方差分析

表6 正交工艺验证实验

表7 各供试品IC50值(n=2)

由表7可知，不同总黄酮含量的样品清除DPPH自由基的能力存在显著性差异，其中优选工艺样品A逐步纯化得到样品B活性强于维生素E而弱于维生素C，最终纯化样品C的活性高于维生素E及维生素C。证明样品A和B对脂溶性自由基有很强的抗氧化活性，样品C由于进一步进行纯化，随着含量的不断提高不但对脂溶性自由基抗氧化活性逐步增强并且对水溶性自由基抗氧化活性也明显增强。

4 结论

4.1 本实验在单因素实验的基础上，采用正交实验法对小飞蓬中总黄酮有效部位的乙醇提取工艺进行了优选，选用L9(34)正交进行考察，实验结果表明小飞蓬有效部位最佳提取工艺条件是，以70%乙醇为提取溶剂，在1∶10料液比条件下提取2次每次1.0 h。该提取工艺简单，条件易于控制，提取率高。

4.2 抗氧化实验表明，黄酮类成分清除DPPH自由基的能力与化合物中酚羟基的取代个数和位置有关;中药清除DPPH自由基能力与总黄酮类成分含量之间存在相关性。小飞蓬中的黄酮类化合物有良好的DPPH清除活性，且随着小飞蓬中总黄酮含量的提高，IC50值也明显提高，即随着小飞蓬中总黄酮含量的提高，其抗氧化活性明显增强。

［1］林 容，陈艺林.中国植物志，菊科(一)［M］.第74卷.北京:科学出版社，1985:295.

［2］刘大奎.灯盏花素治疗糖尿病肾病高粘血症疗效观察［J］.湖北中医杂志，2003，25(5):13－14.

［3］邵 帅，严铭铭，毕胜男，等.小飞蓬化学成分的研究［J］.中国药学杂志，2009，44(14):1053－1055.

［4］张纵圆，彭 秧，索金玲，等.葡萄叶中总黄酮的提取工艺优化及体外抗氧化作用研究［J］.中成药，2009，31(2):292－294.

［5］温梅云，钟 球，钟 鸣.HPLC法测定通淋颗粒中槲皮素和山奈素的含量［J］.国际医药卫生导报，2007，13(4):86－88.

［6］Blois M S.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical［J］.Nature，1958，181:1199－1200.