高效液相色谱法同时测定苦荞中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量

黄兴富， 黎其万， 刘宏程， 王继良， 孙浩岩， 邵金良

(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650223;2.昆明医学院药学院，云南 昆明 650031)

苦荞麦Fagopyrum tataricum又名鞑靼荞麦，是适于在寒冷气候下生长的寥科荞麦属一年生草本双子叶植物，其根、茎、叶、花、种子及籽壳中都含有大量黄酮类化合物，主要成分有槲皮素、山柰酚和芦丁等［1］。传统医学和现代医学都证实苦荞具有降血糖、降血脂、降尿糖、防便秘等功效［2-3］。被权威专家称为“三降食品”和“21世纪人类的健康食品”。此外，苦荞中蛋白质含量也较高，有极高的营养和医药价值［4］。荞麦蛋白除能显著降低血液胆固醇浓度，其效果优于大豆蛋白质［5］，还具有抗衰老、抑制大肠癌的发生等作用。目前国内对植物中的黄酮类化合物的测定主要有比色法，紫外分光光度法和HPLC法［6］，但比色法的干扰因素较多，而紫外分光光度法准确度不高。近年来国内有采用高效液相色谱法测定苦荞黄酮中芦丁、金丝桃苷、牡荆苷、槲皮素等黄酮化合物的含量［7-8］，但尚未见文献报道同时测定芦丁、槲皮素和山柰酚的含量。本试验建立了用高效液相色谱同时测定苦荞中芦丁、槲皮素和山柰酚含量的方法，并对用90%甲醇索氏提取物芦丁、槲皮素和山柰酚的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 戴安Summit高效液相色谱仪;电子分析天平(德国赛多利斯CP-224S，0.1 mg/100 g)。

1.2 试药 芦丁(含量≥98%，批号:100080-200707)、槲皮素(含量≥98%，批号:100081-200406)和山柰酚(含量≥98%，批号:0861-200002)对照品均购于中国药品生物制品检定所;17种不同品种的荞麦(云南省农科院生物与种资资源研究所提供);乙腈为色谱纯(Tedia，美国)，流动相用水为去离子水经0.45 μm膜过滤;甲醇和磷酸均为分析纯。

2 溶液的配制

2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品芦丁10 mg、槲皮素1 mg和山柰酚1 mg，于10 mL量瓶中，用甲醇定容，配成浓度分别为1，0.1和0.1 mg/mL的对照品贮备液。

2.2 供试品溶液的制备 分别精密称取样品 10.0 g，用90%甲醇索氏提取，旋转蒸发浓缩，于100 mL量瓶中，加甲醇定容，取1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。

3 色谱条件

色谱柱:Diamonsil-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流动相组成:乙腈-0.2%磷酸溶液线性梯度洗脱，洗脱程序见表1;流速:1.0 mL/min;检测波长:365 nm;进样量:20 μL。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 混合对照品(A)、样品(B)的色谱图

4 方法与结果

4.1 线性关系考察 精密吸取芦丁、槲皮素和山柰酚对照品贮备液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL;0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL;0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，于 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品混合溶液，取20 μL进样后记录峰面识，以峰面积Y对对照品浓度X绘制标准曲线。得到芦丁、槲皮素和山柰酚的回归方程分别为:

芦丁、槲皮素和山柰酚的线性范围分别为:40～200 μg/mL、2 ～16 μg/mL、1 ～12 μg/mL。液相色谱的信噪比 S/N=3。芦丁、槲皮素和山柰酚的最低检测限分别为0.03 μg/mL、0.009 μg/mL、0.005 μg/mL。

4.2 精密度试验 精密称取6份样品(西苦6-14)10.0 g，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算芦丁、槲皮素和山柰酚的RSD分别为0.84%、0.57%、1.27%。

4.3 稳定性试验 精密吸取芦丁、槲皮素和山柰酚的对照品溶液，配成浓度分别为120、8、4 μg/mL在室温下放置，分别在 0、2、4、8、12、24 h 时测定，计算得芦丁、槲皮素和山柰酚峰面积RSD分别为0.78%、0.83%、1.34%。表明对照品溶液在24 h内稳定。

4.4 重复性试验 分别精密称取样品(西苦6-14)6份，按2.2项下的供试品溶液制备方法制备，进样20 μL，记录峰面积，测得样品中芦丁、槲皮素和山柰酚含量的RSD分别为0.77%、0.51%和1.18%。

4.5 加样回收率试验 精密称取样品(西苦6-14)11份，每份约10.0 g，样品按2.2项处理。1份是空白，其余10份分为2组，分别精密加入约相当于样品中芦丁、槲皮素和山柰酚含量80%、120%的对照品(各5个)，按供试品溶液制备和测定方法操作，计算芦丁、槲皮素和山柰酚的平均回收率分别为:97.86%、99.02%、97.85%。见表2。

4.6 样品含量测定 分别精密称取每个品种的苦荞3份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件和测定方法，测定峰面积，外标法计算，结果每个品种的苦荞中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量分别见表3。

5 讨论

5.1 波长的选择 本试验考擦了260 nm和365 nm不同吸收波长的图谱，发现芦丁、槲皮素和山柰酚的最大吸收波长不一，在365 nm波长下槲皮素和山柰酚有最大吸收，而芦丁也有较好的吸收，且干扰少，图谱特征性强。故选择365 nm为检测波长。

5.2 流动相的选择 在实验过程中曾试过甲醇-水，乙腈-水溶液等为流动相，分离效果均不理想，色谱峰拖尾严重，而采用乙腈-0.2%磷酸水溶液后分离效果有明显的改善，且峰形均较好，无拖尾现象，故最后选择乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相。

5.3 提取方法的选择 对苦荞的提取方法做了下列考察(溶剂为甲醇和乙醇):索氏提取法、浸渍法、回流提取法、超声波提取法，发现用索氏提取法，溶剂为甲醇的效果最好。又对60%、80%、90%和100%的甲醇做了考擦，结果发现90%的甲醇提取的黄酮是最多的，尤其是山柰酚。

表2加样回收率试验(n=5)

表3 不同来源苦荞中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量(n=3)

5.4 样品测定结果分析 从测定结果看，10个不同来源苦荞中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量存在较大的差异:云荞53中芦丁的含量最高，KQ08-10中芦丁的含量最少;KQ08-10中槲皮素的含量最高，四川西昌苦3-7中槲皮素的含量最少;KQ08-06中山柰酚的含量最高，四川梁山苦和云荞63中都没检测到山柰酚。

这为寻找苦荞同时具有高含量芦丁、槲皮素和山柰酚等黄酮化合物提供了可能，为以后品质性状的选择或杂交选育提供了依据。

5.5 小结 本试验采用 HPLC法同时测定苦荞中芦丁、槲皮素和山柰酚3种成分的含量，方法简便快速，结果准确，可用于苦荞的质量控制。

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