急性子中黄酮类成分HPLC指纹图谱的初步研究

王 巍， 鞠成国， 朱 旭， 赵焕君

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600;2.沈阳南六成大方圆医药有限公司，辽宁沈阳 110005)

急性子为凤仙花科植物凤仙花Impatiens balsaminaL.的干燥成熟种子［1］，始载于《救荒本草》，具有破血软坚，消积的功效，用于治疗癥瘕痞块，经闭，噎膈。据文献报道急性子中含有黄酮类、皂苷类、脂肪油等化合物［2－7］，其中所含的黄酮类化合物具有多种生物活性，除抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有显著效果［8］。本试验采用HPLC法，建立急性子中黄酮类成分的指纹图谱［9－11］，并对 11 个不同产地药材的相似性进行分析。

1 仪器与材料

电子天平(FA1004B)，超声波清洗器(SB5200D)，紫外－可见分光光度计(日立U3010)，高效液相色谱仪(Agilent 1100系列);槲皮素(100080－200406)、山 柰 酚 (0861－200002)、芦 丁(100080200306)购自中国药品生物制品检定所;急性子药材分别于2008年11月收集于江苏无锡(S1)、安徽六安(S2)、福建三明(S3)、辽宁抚顺(S4)、安徽亳州(S5)、河北安国(S6)、河南郑州(S7)、辽宁沈阳(S8)、苏州太湖(S9)、云南昆明(S10)、浙江杭州(S11)，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为凤仙花科植物凤仙花Impatiens balsaminaL.的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil TM C18柱(250 mm ×4.6mm，5 μm);流动相:甲醇(A)－0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0 min:35%A;15 min:45%A;30 min:60%A;45 min:75%A;50 min:100%A);检测波长:365 nm;柱温:30℃;流速:1.0 ml/min。

2.2 供试品溶液制备 取急性子药材炒黄，破碎，取粉末5 g，精密称定，置具塞三角瓶中;加入乙醚30 mL，超声处理20 min，弃去乙醚液，水浴挥散乙醚至药渣无醚味;精密加入70%甲醇40 mL，称重，超声处理40 min，取出，放凉，称重(必要时补足所失重量)，滤过，取续滤液经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，滤液备用。

2.3 对照品溶液制备 分别精密称取槲皮素、山柰酚和芦丁对照品适量，加甲醇制成浓度为0.005 56 mg/mL、0.002 42 mg/mL 和 0.017 2 mg/mL 的溶液，备用。

2.4 测定方法 分别精密吸取不同产地供试品溶液及对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。

2.5 HPLC指纹图谱的建立

2.5.1 共有峰的确定 以槲皮素色谱峰为参照，确定其相对保留时间为1，计算其它色谱峰的相对保留时间，标定出12个共有峰，结果见表1。指纹图谱见图1。经与对照品相比较，确定9号共有峰为芦丁，12号共有峰为山柰酚。11个不同产地急性子药材指纹图谱叠图见图2。

表1共有峰的相对保留时间Tab.1 Relative retention time of common peaks

图1 急性子药材HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of Impatientis Semen

2.5.2 共有峰相对峰面积 以槲皮素色谱峰面积作为1，计算其它各共有峰的相对峰面积。结果不同样品共有峰相对峰面积差异较大，表明不同地区的急性子药材质量之间存在较大差别。结果见表2。

2.5.3 共有峰面积 对11个不同产地药材的色谱峰面积进行统计，计算各自共有峰面积占总峰面积的百分比，结果在90.3% ～94.8%之间，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的相关规定。结果见表3。

图2 11个产地急性子药材HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint for 11 different habitats of Impatientis Semen

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度考察 取同一份供试品溶液(S11)，连续进样6次，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间RSD＜0.8%，相对峰面积RSD＜1.0%。结果表明，仪器精密度良好。

表2共有峰的相对峰面积Tab.2 Relative peak areas of common peaks

表3 共有峰面积百分比Tab.3 Percentage of the common peak areas

2.6.2 稳定性考察 取同一份供试品溶液(S11)，分别在 0、2、4、8、16、24 h 测定，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间RSD＜1.2%，相对峰面积RSD＜1.6%。结果表明，24 h内测定，样品稳定性良好。

2.6.3 重复性考察 取急性子药材(S11)5份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进行测定。各共有峰的相对保留时间RSD＜1.1%，相对峰面积RSD＜2.0%。结果表明，方法重复性良好。

2.7 相似度评价［12］采用平均矢量法对11个不同产地的急性子药材指纹图谱建立共有模式，作为对照指纹图谱，将每张指纹图谱与其进行比较，得到各谱与对照指纹图谱的相似度。结果见表4。试验结果提示，S1～S5和S7～S11与对照图谱的相似度均达到0.9以上，符合要求。S6和S7与对照图谱的相似度为0.85，小于0.9，但由性状鉴别无法否定其为急性子药材，因此有待于进一步采用化学模式识别方法作进一步评价。

表4相似度考察Tab.4 Investigation of similarity

3 讨论

3.1 提取溶剂考察 鉴于黄酮类成分在一定浓度的醇水中溶解度较大，因而本试验拟采用甲醇为溶媒，分别对甲醇、70%甲醇、50%甲醇的提取情况进行考察。试验结果提示，甲醇提取的样品色谱图中，色谱峰个数较少，峰面积小，表明提取效率较低，可能因为急性子中黄酮类成分主要以苷的形式存在;70%甲醇提取的样品色谱图中，色谱峰个数较多，峰面积较大;50%甲醇提取的样品色谱图中，色谱峰较70%甲醇提取时峰面积小，灵敏度相对较低。因而确定70%甲醇为提取溶剂。

3.2 超声提取时间考察 超声提取操作简单，提取效率高，适于对大量样本的提取，因而本试验采用超声提取的方法制备供试品溶液，并对超声提取时间进行考察。试验结果提示，超声提取40 min后，色谱峰数目及色谱峰面积基本稳定。

3.3 色谱条件选择考察

3.3.1 检测波长的选择 试验中对槲皮素、山柰酚、芦丁进行紫外全波长扫描，综合它们最大吸收情况，分别在260 nm和365 nm下检测。试验结果提示，检测波长为365 nm时的色谱峰数目明显多于260 nm，并且灵敏度较高，因此确定365 nm为检测波长。

3.3.2 流动相的选择 试验中分别对甲醇－水、甲醇－磷酸三乙胺水溶液、甲醇－0.4%磷酸水溶液不同梯度洗脱系统进行筛选。最后确定流动相为甲醇－0.4%磷酸水溶液，按前述系统梯度洗脱，各色谱峰分离较好。

4 结论

急性子药材目前临床应用较少，但从文献报道来看，其在治疗食道癌方面确有独到之处。由于《中国药典》对急性子药材尚无定性、定量检查方法，本试验采用HPLC法建立急性子中黄酮类成分指纹图谱，旨在为急性子药材的质量控制提供试验依据。试验结果表明该方法重现性好，可操作性强，可用于对急性子药材的定性鉴别。试验中发现，标定的各共有峰相对色谱峰面积相差较大，考虑应与药材的生长环境有关，在临床应用中，为保证其疗效的稳定，应对药材的产地进行规定，这也是实行中药GAP的意义所在。试验中对部分指纹峰进行了归属，下一步会对其含量进行测定，建立急性子药材中黄酮类成分的质量控制方法，而该类成分与疗效的关系则有待于进一步的研究。

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