牛磺酸对阿霉素所致大鼠心肌线粒体损伤的影响

张晓丹， 蔡瑞雪， 吕高照， 曲彩霞

(1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨 150076;2.哈尔滨市红十字医院，黑龙江哈尔滨 150076)

阿霉素(Adriamycin，Adr)是一种高效的广谱抗肿瘤药物，该药抗瘤谱广、疗效显著。自1970年用于临床治疗肿瘤以来［1］，被认为是治疗实体肿瘤最有效的药物。但是因其严重的心脏毒性限制了它在临床上的应用［2－3］。研究表明，心肌线粒体是其主要的毒性靶点之一［4－7］。牛磺酸(Taurine，Tau)从发现至今已有160多年的历史，因1827年首次从牛胆汁中分离出而得名［8］。研究表明，Tau的抗脂质过氧化作用和膜稳定作用可保护线粒体膜免受脂质过氧化，保持线粒体膜的完整性，从而维持线粒体结构和功能的稳定［9］。心肌线粒体损伤是 Adr引起心脏毒性发生的主要标志，而Tau能否通过对心肌线粒体的影响而减缓 Adr引起的心脏毒性，目前还未报道。本实验旨在探讨Tau对Adr所致大鼠心肌线粒体损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠，180～220g/只，共40只，由哈尔滨医科大学动物实验研究中心提供，动物合格证号为SCXK(京2007－0001)。

1.1.2 药品与试剂 Tau(上海生物化学试剂公司提供，纯度＞99%);阿霉素由深圳万乐药业有限公司生产，批号H44024359;Rhodamine123购于美国Sigma公司，分析纯;其它试剂均为国产。

1.1.3 实验仪器 JEM2100CXⅡ透射电镜(日本电子公司);2100MP激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司);Langendorff灌流系统(美国Radnoti公司);RF25210荧光分光光度计(日本岛津公司);低温高速离心机(德国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 健康Wistar大鼠40只，♀♂各半，随机分成5组，每组8只。(1)Adr组:于实验开始后第2、4天腹腔注射Adr 1 mg/kg，第6、8天腹腔注射 Adr 2 mg/kg，第10、12天腹腔注射Adr 3 mg/kg，第 14、16 天腹腔注射 Adr 4 mg/kg，16天累计用药剂量达 20 mg/kg［10－11］。(2)Adr+TauⅠ组:Tau 灌胃给药［12－13］灌胃给药 100 mg/(kg·d);(3)Adr+TauⅡ组:Tau灌胃给药200 mg/(kg·d);(4)Adr+TauⅢ组:Tau灌胃给药400 mg/(kg·d)。各组Tau于实验第一天起开始给药，每日灌胃1次，连续16 d，同时，Adr的给药时间、给药剂量、给药次数同Adr组。Tau灌胃给药是在腹腔注射Adr前30min;(5)阴性对照组:实验处理同Adr组，腹腔注射等剂量生理盐水。

1.2.2 心肌组织的电镜观察 大鼠处死后，迅速取出心脏，在心尖处取约1 cm3的心肌组织，用2.5%的戊二醛固定，再经漂洗、脱水、浸透、包埋、切片、染色后进行电镜观察。

1.2.3 心肌细胞Ca2+浓度的测定 动物脱臼处死，取出心脏，置预冷的50 mol/L Tris－HCl缓冲液冲洗，剪碎，制备匀浆，过滤，离心，弃上清，沉淀用缓冲液复溶后再次离心同前，所得沉淀用缓冲液调整蛋白浓度值为0.8 g/L，考马斯亮兰法测定膜悬液［14］蛋白浓度，新鲜即用。取稳定好的细胞，离心，去上清后，用无钙台氏液洗涤，然后用Fluo－3AM染色，终浓度为2 μg/mL，避光，在37℃恒温水浴中孵育0.5 h，离心，用KB液洗涤，将细胞稀释，放入200～300 μL的浴槽。将Fluo－3AM负载好的细胞在激光扫描共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长为488 nm，放射波长526 nm，其荧光值与［Ca2+］i正相关，即以荧光值(FI)变化表示［Ca2+］i变化。

1.2.4 心肌线粒体膜电位的测定

1.2.4.1 心肌线粒体的制备［15］将大鼠饥饿处理多于12 h以上，以去除心肌组织内的糖元和脂肪;断头处死大鼠，取下心脏，剥离瓣膜，挤去心脏中的血液，放于冷的蒸馏水中洗去血液;迅速浸入0℃的匀浆介质中(匀浆介质的成分mmol/L:甘露醇225，蔗糖75，EDTA 1和0.25%的牛血清白蛋白，pH 7.4)。用组织剪将心肌剪成米粒样大小，同时去除脂肪和结缔等组织。将剪碎的心肌和匀浆液倒入匀浆管中，在冰浴下进行匀浆，进行20 min，匀浆基本彻底。按照差速离心法分离线粒体。采用考马斯亮兰法测定线粒体蛋白含量，调整线粒体蛋白浓度为1 mg/mL。

1.2.4.2 膜电位的测定 参照文献［16］将反应介质(蔗糖150 mmol/L，氯化镁5 mmol/L，琥珀酸钠5 mmol/L，鱼藤酮 2.5 mmol/L，Hepes 20 mmol/L)加入到各组线粒体悬液中，浓度为26 μmol/L的Rhodanmine123，室温下反应5 min;Rh123的激发波长为503 nm，发射波长为527 nm的条件下测定荧光强度。

1.3 统计学处理 数据以均数±标准差表示，均数比较用单因素方差分析(one－way ANOVA)，所有实验数据采用SPSS 16.0进行统计分析。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 Tau对心肌细胞超微结构的影响 见图1。从图中可见:A.阴性对照组:心肌细胞完整，肌原纤维排列整齐，心肌纤维纹理清晰。线粒体结构清晰，膜较完整，基质清楚。B.Adr组:肌原纤维排列紊乱，肌纤维断裂;线粒体肿胀出现空泡变，内腔扩大，膜模糊不清;嵴排列稀疏，有断裂，肌节消失。C.Adr+TauⅠ组:对心肌保护作用较小，线粒体肿胀轻微减轻，但仍有空泡变出现，嵴仍有改变。D.Adr+TauⅡ组:心肌纤维肿胀进一步减轻，仍有个别线粒体出现轻度肿胀，肌节断裂减少。E.Adr+TauⅢ组:心肌显微结构基本恢复正常，线粒体肿胀减轻，结构较完整，嵴排列较整齐、致密，基本接近阴性对照组。

图1 Tau对心肌细胞超微结构的影响Fig.1 Effects of Tau on ultrastructure of cardiac muscle cell in electron microscope

2.2 Tau对心肌细胞Ca2+含量及线粒体膜电位的影响 由表1可知:与阴性对照组相比，Adr组Ca2+浓度明显升高，TauⅢ组能使心肌细胞内Ca2+浓度明显下降(P＜0.01)，TauⅡ组能使心肌细胞内Ca2+浓度显著降低(P＜0.05)，TauⅠ组心肌细胞内Ca2+浓度明显升高(P＜0.05)。说明TauⅢ组能降低心肌细胞内Ca2+浓度，缓解钙超载。而与阴性对照组相比，Adr组心肌线粒体膜电位显著下降(P＜0.05);给予Tau可使线粒体膜电位升高，TauⅡ、Ⅲ组可明显升高心肌线粒体膜电位(P＜0.05)，提示Tau可明显减轻Adr所致的大鼠心肌线粒体损伤。

表1 Tau对心肌细胞Ca2+含量、线粒体膜电位的影响(n=8，±s)Tab.1 Effects of Tau on the［Ca2+］i and MMP of myocardial mitochondria(n=8，±s)

表1 Tau对心肌细胞Ca2+含量、线粒体膜电位的影响(n=8，±s)Tab.1 Effects of Tau on the［Ca2+］i and MMP of myocardial mitochondria(n=8，±s)

与阴性对照组比较*P＜0.05，与Adr组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。*P ＜0.05 **P ＜0.01 vs.Normal△P ＜0.05 △△P ＜0.01 vs.ADR group

组别 剂量/(mg/kg) Ca2+荧光值－ 23.35±4.41 144.82±34.25 Adr组 － 31.84±5.06* 102.56±31.77*Adr+TauⅠ组 100 34.58±2.32 116.10±27.56 Adr+TauⅡ组 200 25.66±0.40△ 133.37±33.61△Adr+TauⅢ组 400 21.11±2.50△△ 141.07±29.12膜电位荧光强度阴性对照组△

3 讨论

自从1973年Lefrak首次报告了Adr心脏毒性，认为它比骨髓抑制作用、消化道和肾脏毒性等更为危险，由于心脏毒性而限制其作用。因此越来越多的学者就Adr引起的心脏毒性而进行了研究。研究认为，目前对Adr心肌毒性的机制尚未彻底清楚，可能包括自由基、钙超载、细胞凋亡和线粒体损伤等多因素共同作用的结果，多因素之间互相联系、互为因果，形成Adr心脏毒性的恶性网络，共同导致心脏毒性的发生和发展［17］。本实验就Adr可能产生的机制进行了研究，并从该机制着手，观察了Tau对Adr大鼠心脏毒性的影响。

Adr引起心脏毒性的可能机制有:钙超载和线粒体损伤。正常心肌细胞中Ca2+大部分储存于线粒体、肌浆网及肌膜上。Adr能破坏心肌细胞膜结构的完整性，影响膜的渗透性刺激线粒体和肌浆网，将Ca2+释放至胞质，加重 Ca2+超载［18］。线粒体在心肌细胞的能量代谢中起重要作用，其摄取Ca2+的速度很慢，但存储量很大，是调节细胞内Ca2+浓度的主要细胞器之一。研究表明Adr通过一种特异性的线粒体通透性转运阻滞剂环孢菌素A作用于钙释放通道而破坏线粒体内Ca2+的调节作用［19］。大量证据表明，在Adr引起的心脏毒性发病过程中，线粒体是主要靶向器官。Adr心脏毒性时产生大量氧自由基，线粒体发生脂质过氧化反应使线粒体受损，极容易发生线粒体功能障碍。Ca2+的蓄积与线粒体损伤，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成减少。Adr还可使线粒体的NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、细胞色素还原酶及琥珀酸脱氢酶的活性降低，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成障碍，严重影响心肌的收缩和舒张功能。

本实验结果显示，Adr组大鼠心肌细胞超微结构明显改变，表现为线粒体弥漫性肿胀，内腔扩大，空泡变。Adr可使心肌细胞内Ca2+浓度增加，加重钙超载，也可显著降低线粒体膜电位。说明Adr所致心脏毒性模型制备成功，提示线粒体损伤可能是阿霉素引起心脏毒性的主要机制。上述结果表明大剂量的Tau可改善Adr所致的大鼠心肌线粒体的病理改变，减轻钙超载，提高线粒体膜电位。说明Tau有可能是通过减缓钙超载及减轻线粒体损伤来防治Adr所致的心脏毒性。小剂量的Tau轻微的减轻线粒体损伤，但加重了钙超载，对心脏毒性并不能起有效的防治作用。

综上所述，大剂量Tau可以非常显著的改善线粒体损伤，钙超载及提高膜电位，且无毒副作用。同时本实验还证明了小剂量Tau不适用于防治Adr所致的心脏毒性。目前随着Adr在肿瘤治疗领域中具有不可替代的作用，其心脏毒性也越来越受到人们的重视。Tau能有效的防护心脑毒性［20］，为临床应用Adr后的心肌保护性辅助用药提供了治疗策略。

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