丹参注射液对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗NOS异构体表达的影响*

王爱梅，汤 浩，宝东艳，于 利

(1.辽宁医学院生理学教研室，锦州 121001;2.中国医科大学生理学教研室，辽宁 沈阳 110001)

丹参注射液(salvia miltiorrhiza injection，SM)系由传统中药丹参提取制得，具有清除氧自由基、防止脂质过氧化、改善微循环等多种药理作用。研究表明，SM可有效抑制庆大霉素(gentamicin，GM)耳中毒后豚鼠耳蜗一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的表达，以减少NO的过量生成，从而拮抗GM的耳蜗毒性[1]。已知催化合成NO的NOS异构体有三种类型，即神经元型(neuronal NOS，nNOS/NOSⅠ)、诱导型(inducible NOS，iNOS/NOSⅡ)和内皮型(endothelial NOS，eNOS/NOSⅢ)，SM是否对这三型NOS的表达都有影响目前尚不清楚。为此，本研究通过免疫组织化学方法及显微图像分析技术，结合听脑干反应(auditory brainstem response，ABR)测试，观察SM 对GM耳中毒后豚鼠耳蜗NOS三型异构体表达的影响，以进一步探讨SM对GM耳毒性的防护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康白毛红目豚鼠，耳廓反射正常，体重250～300g，雌雄不限，由中国医科大学第二临床学院动物室提供;丹参注射液购自上海中西制药有限公司;硫酸庆大霉素购自天津药业集团新郑股份有限公司;兔抗nNOS/NOSⅠ和抗eNOS/NOSⅢ抗体为Santa Cruz公司产品，兔抗iNOS/NOSⅡ抗体为Sigma公司产品;即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 实验动物分组及耳毒模型制备

将豚鼠随机分成4组(n=10):对照组、GM组、SM组和GM+SM组。GM组每日腹腔注射硫酸庆大霉素100mg/kg;SM组每日腹腔注射丹参注射液6 g/kg;GM+SM组同时注射硫酸庆大霉素和丹参注射液;对照组则每日腹腔注射与GM等量的生理盐水2.5 ml/kg。四组皆连续用药10d。用药期间每天监测动物体重以调整药量。

1.3 ABR测试

各组动物于用药前及停药第2天分别测试ABR。操作在隔音屏蔽室内进行。豚鼠用1%戊巴比妥钠40mg/kg经腹腔麻醉后，将电极的正极置于动物颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下。利用Danac-7型声刺激器发出2000Hz为主的短声(click)刺激信号，间隔90ms，带通滤波 50～ 3000Hz，叠加 200次，扫描时程20ms。声刺激强度从95 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，观察P3波以判定两侧耳的ABR阈值。

1.4 耳蜗标本制备

待各组动物停药并测试完ABR后，立即断头处死，速取听泡。充分暴露耳蜗后，在体视显微镜下刺破前庭窗及蜗窗，蜗尖钻孔并缓慢灌流含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)，并将标本浸入该固定液中4℃下2 h。经PBS冲洗后放入10%的EDTA中，4℃下脱钙20～25 d。然后移入25%蔗糖溶液中4℃过夜沉淀。用OCT包埋耳蜗，行20μm恒冷冰冻切片。

1.5 免疫组织化学方法检测NOS表达

切片干燥后用蒸馏水冲洗。0.5%H2O2室温孵育切片30min，蒸馏水冲洗。抗原修复液处理10min，蒸馏水冲洗。以正常血清封闭液室温下孵育切片20min后，滴加抗NOSⅠ～Ⅲ抗体(抗nNOS/NOSⅠ1∶400;抗 iNOS/NOS Ⅱ1∶4000;抗 eNOS/NOS Ⅲ 1∶100)，4℃过夜，PBS冲洗。加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗。加SABC试剂，37℃孵育30min，PBS 冲洗。DAB显色，脱水，透明，封片，显微镜下观察。阴性对照染色切片用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)代替一抗，其它实验步骤不变。

1.6 显微图像分析技术

每组随机抽取10张切片，置于显微镜下呈现图像后，用数码照相机拍照，并将图像输入计算机。应用Luzex-F图像分析仪，在同等条件下测量耳蜗血管纹、螺旋韧带、螺旋器和螺旋神经节处三型NOS阳性反应产物的灰度值，分别计算每组各部位的平均灰度值。灰度值越小，表示阳性反应越强烈。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 SM对GM耳中毒豚鼠ABR阈值的影响

连续用药10d后，GM组ABR阈值比用药前明显升高，并且与对照组比较差异显著(P＜0.01)。GM+SM组ABR阈值虽然在用药后也有增高，但较GM组明显降低(P＜0.01)。SM组与对照组ABR阈值无明显差异(表1)。

Tab.1 ABR thresholds of guinea pigs in each group(，n=20ears)

Tab.1 ABR thresholds of guinea pigs in each group(，n=20ears)

ABR:Auditory brainstem response;GM:Gentamicin;SM:Salvia miltiorrhiza injection**P＜0.01 vs before administration;##P＜0.01 vs control group;△△ P＜0.01 vs GM group

Group ABR thresholds(dB SPL)Before administration After administration Control 19.5±5.5 20.5±6.4 GM 19.0±6.2 37.5±3.5**##SM 18.0±6.3 18.5±6.7 GM+SM 20.0±3.3 28.5±4.1**△△

2.2 SM对GM耳中毒豚鼠耳蜗NOS异构体表达的影响

2.2.1 iNOS/NOSⅡ 光镜下观察，可见对照组豚鼠耳蜗中iNOS的阳性染色较弱，其免疫反应产物呈棕黄色颗粒，分布于耳蜗血管纹(stria vascularis，SV)、螺旋韧带(spiral ligament，SL)、螺旋器(the organ of Corti)和螺旋神经节(spiral ganglion，SG)细胞的胞浆内。GM组、SM组和GM+SM组豚鼠耳蜗中iNOS阳性反应产物的分布与对照组大致相同，但GM组的阳性染色比对照组明显加深，阳性颗粒显著增多，而GM+SM组的阳性染色则较GM组明显减弱(图1～3)。显微图像分析结果显示，GM组豚鼠耳蜗各部位iNOS免疫反应的平均灰度值较对照组明显减小(P＜0.01)，即GM 组耳蜗iNOS表达显著增强;而GM+SM组豚鼠耳蜗iNOS免疫反应的平均灰度值则较GM组有所增大，即iNOS表达明显弱于GM组(P＜0.05，P＜0.01，表2)。

Tab.2 Average gray value of iNOS immunoactivity in the guinea pig cochleae of each group(，n=10)

Tab.2 Average gray value of iNOS immunoactivity in the guinea pig cochleae of each group(，n=10)

SV:Stria vascularis;SL:Spiral ligament;SG:Spiral ganglion;GM:Gentamicin;SM:Salvia miltiorrhiza injection**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs GM group

Group Average gray value SV SL Organ of Corti SG Control 110.48±10.60 125.15±10.80 127.59±6.32 116.91±8.72 GM 90.01±9.02** 101.30±9.14** 102.31±7.51** 97.44±7.92**SM 111.20±9.89 126.13±9.54 128.18±8.14 119.06±9.66 GM+SM 99.89±6.19# 114.67±9.49## 116.67±6.18## 108.28±6.73##

Fig.1 Expression of iNOS in the SV and SL of guinea pig cochleae(SABC method of immunohistochemistry，cryostat section×200)

Fig.2 Expression of iNOS in the organ of Corti of guinea pig cochleae(SABC method of immunohistochemistry，cryostat section×200)

2.2.2 nNOS/NOSⅠ和eNOS/NOSⅢ 光镜下可见，各组豚鼠耳蜗中nNOS和eNOS阳性反应产物亦为棕黄色颗粒，并且与iNOS的分布大致相同，但各组间nNOS和eNOS阳性染色无明显差别。显微图像分析结果表明，各组间nNOS和eNOS免疫反应的平均灰度值无显著性差异。

Fig.3 Expression of iNOS in the SG of guinea pig cochleae(SABC method of immunohistochemistry，cryostat section ×400)

2.3 豚鼠耳蜗各部位 iNOS免疫反应的平均灰度值与ABR阈值的关系

连续给药10d后，各组豚鼠耳蜗不同部位iNOS免疫反应的平均灰度值发生变化，同时伴有ABR阈值的改变，提示二者之间关系密切。通过直线相关检验证明二者高度相关(|r|＞0.7，表3)，表明iNOS表达越强，ABR阈值越高。

Tab.3 Correlation between average gray value of iNOS immunoactivity and ABR thresholds of guinea pig from each group(，n=10)

Tab.3 Correlation between average gray value of iNOS immunoactivity and ABR thresholds of guinea pig from each group(，n=10)

SV:Stria vascularis;SL:Spiral ligament;SG:Spiral ganglion;GM:Gentamicin;SM:Salvia miltiorrhiza injection**P＜0.01

Correlation coefficient SV SL Organ of Corti SG rControl -0.951**-0.973** -0.956** -0.952**rGM -0.878**-0.900** -0.861** -0.802**rSM -0.973**-0.916** -0.895** -0.933**rGM+SM -0.951**-0.932** -0.855** -0.905**

3 讨论

研究表明，NOS三型异构体均存在于豚鼠耳蜗结构中，并且可在生理状态下表达其活性[2，3]，而病理状态下iNOS的诱导表达及其产生的大量NO可能参与了内耳疾病的发病过程[4，5]。Shi等[4]发现噪声暴露可诱导豚鼠耳蜗螺旋器毛细胞及SV边缘细胞内iNOS的高表达，提示iNOS参与了噪声所致听力丧失。Watanabe等[5]报道给予耳毒性药物顺铂后，小鼠耳蜗SV和SL中iNOS表达增强，同时伴有ABR阈移增大，提示iNOS介导了顺铂的耳毒性，导致听力丧失。本研究结果显示，单独接受GM注射10d后，豚鼠耳蜗SV、SL、螺旋器和SG细胞中iNOS表达明显增强，且与ABR阈值升高高度相关，表明iNOS及其产生的大量NO也参与了GM耳中毒过程，进一步证实了本研究室的前期工作结果。此外，我们还观察到，GM耳中毒后，豚鼠耳蜗各部位nNOS和eNOS的表达与对照组比较并无显著性差异，这与Hess等[6]的报道相似。他们将细菌性脂多糖和肿瘤坏死因子α的混合物注入豚鼠鼓室腔后，耳蜗nNOS和eNOS的表达也无改变。综合我们的研究结果，提示GM可能并不影响nNOS和eNOS的表达，而是通过使iNOS表达显著增强，进而产生过量的NO，引起耳蜗损害，导致听力丧失。

SM主要是中药丹参的水溶性成分，包括丹参素、丹参酮及丹酚酸等。近来的研究表明，SM及其有效单体均可通过抑制iNOS的表达而发挥防护作用，如SM可抑制慢性缺氧大鼠肺小动脉内iNOS的表达，从而影响缺氧性肺动脉高压形成中的肺小动脉重构[7];丹参酮能降低β淀粉样蛋白诱导的iNOS高表达，从而防护β淀粉样蛋白对大鼠海马神经元的损伤[8]。此外，SM还可明显降低链霉素所致豚鼠ABR阈值升高，并可抑制耳蜗SG细胞内iNOS的过表达，从而减轻耳毒性损伤[9]。本研究结果显示，GM+SM组豚鼠耳蜗SV、SL、螺旋器以及SG细胞中nNOS、eNOS和iNOS的分布均与GM 组相同，且其nNOS和eNOS表达与GM组比较无显著性差异，但iNOS表达则明显弱于GM组，同时豚鼠ABR阈值也显著降低，并且与iNOS表达下调高度相关。由此提示，SM虽然对GM耳中毒后豚鼠耳蜗各部位nNOS和eNOS表达无明显影响，但可抑制GM所致iNOS表达的增强，以减少NO的过量生成，从而发挥对GM耳毒性的防护作用。至于SM下调GM耳中毒豚鼠耳蜗iNOS表达的具体机制，还有待于今后更深入的研究。

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