大鼠皮质脊髓束神经电信号的记录与分析方法研究*

沈卫星，袁 颖，姜正林，吕广明，姚 健

(1.南通大学医学院，2.江苏省神经再生重点实验室，3.南通大学航海医学研究所，江苏 南通 226001)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的神经系统损伤。脊髓损伤因损坏了皮质脊髓束(corticospinal tract，CST)，损伤平面以下仍存活的脊髓神经细胞失去了大脑的神经支配，不能进行随意性的运动。脊髓损伤后随意运动功能的恢复，很大程度上取决于皮质脊髓束的轴索再生，及其与脊髓前角运动神经元直接或间接的结构与功能联系的重建。

脊髓损伤后的皮质脊髓束轴突再生与功能重建是世界性的医学难题。临床对脊髓损伤的治疗，在减轻继发性损伤、减少并发症的基础上，采用移植修复、分子干预、免疫治疗、转基因治疗及组织工程修复等方法促进脊髓再生与修复。目前，这些治疗方法存在诸多局限性。在重建脊髓与大脑的神经通路方面，尤其是皮质脊髓束的功能重建，虽然实验研究取得了令人鼓舞的结果，然而尚没有临床成功应用的报道。近年来，随着微电极技术、计算机信息技术、材料科学的发展，采集脊髓损伤上游神经传导束或运动中枢在发出相应运动指令时的电生理信号，经植入的微电子芯片分析解码，通过植入于脊髓相应节段内的微电极输出至运动神经元，从而实现机体功能的重建成为一个新的研究方向。若相关研究取得突破，将为脊髓损伤病人实现运动功能的恢复提供一个全新的康复治疗方法，这无疑对截瘫病人的康复具有重要的意义。

脑-机接口技术(brain-machine interface，BMI)通过实时采集大脑皮层各区神经元作出相应运动指令时的电生理信号，经分析解码实时控制机器臂等外接功能装置，实现部分机体功能的重建[1]。在脊髓损伤处植入微电极芯片，采集分析大脑皮层发出的运动控制信号，整合处理后输出到下行通路从而实现机体功能重建，将为脊髓损伤病人实现运动功能的恢复提供一个全新的治疗方法。本研究探索皮质脊髓束电生理信号的采集记录方法，分析描述电信号的特征，从而为通过植入式微电极阵列进行信号采集的记录方法建立一定的实验基础，为将来进一步研究脊髓损伤修复与功能重建提供有价值的神经电生理基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康雄性SD大鼠，清洁级，体重240～260g。由南通大学实验动物中心提供。

1.2 试剂及仪器

0.1 %Luxol fast blue(Sigma公司);神经信号采集处理系统(cerebus system，美国联合科技集团);微电极推进器(Pf5-1，日本光电);记录电极(尖端直径50-80μm，阻抗 550±40kΩ);神经信号分析软件(Off-line Sorter，Neuroexplorer);恒冷冰冻切片机(CM1900-Cryostat，德国Leica公司);正置显微镜(Leica DMR，德国Leica公司)。

1.3 动物手术

将大鼠称重，经腹腔注射复合麻醉剂(每100ml含水合氯醛4.25 g、硫酸镁2.12 g、戊巴比妥钠2.12 g，剂量0.2 ml/100g bw)，完全麻醉后固定头颈及四肢，剪除术区鼠毛，0.5%碘伏液消毒，确定T7-8脊髓，以T8棘突为中心作背部正中切口，长约2 cm，依次切开皮肤、皮下组织，剥离椎旁肌肉，咬除T8棘突和全椎板至椎弓根部，部分咬除T7和T9椎板扩大椎管，显露脊髓硬脊膜(长约l cm)。用显微镊沿正中线轻轻挑开硬脊膜，暴露脊髓，覆盖浸有生理盐水的纱布。

1.4 电极定位

参照Watson等的著作《The Rat Brain》和刘苏等的相关研究[2]，确定待插入电极的位置:T8处电极深度680μm～800μm。将电极首先夹于液压式微电极推进器的头端，并将其固定于立体定位仪的移动臂。调节移动臂位置，使微电极垂直位于大鼠脊髓上方。微电极尖端位于脊髓后正中沟偏右180～200μm的上方。在距将要插入的电极约1 cm处的肌肉内插入参比电极，在大鼠右侧大腿肌肉插入针灸针，用导线接入记录系统的接地端子作动物接地。调节液压式微电极推进器以10μm的推进间隔将记录电极插入暴露的脊髓内，插入深度为680μm～800μm。

1.5 皮质脊髓束电信号的记录

Cerebus神经信号采集处理系统的各项参数设置:采集窗口时间长度1.6 ms，采集窗口信号幅度200～ 600μV，采样频率 30kHz，前置放大器放大倍数5000，高通滤波250Hz，低通滤波7.5 kHz，有效阈电位选择为-60～-80μV。观察记录窗口的扫描波形，适当调整记录电极的深度，直至记录窗口出现大于阈电位的放电波形，利用记录系统软件提供的色标，以不同颜色区分不同记录波形，将记录窗口不同的叠加波形分别显示于各子窗口。实时观察信噪比(signal noise ratio，SNR)的大小，当稳定的SNR值大于2.5时记录采集放电信号，以200s为一采集记录时间长度，以系统规定的文件格式存储以作进一步离线分析。每次实验正常记录40～60min。剪断电极下游脊髓，观察采集窗口波形变化，采集记录200s。剪断电极上游脊髓，观察采集窗口波形变化，采集记录200s。

1.6 电极位置的确认

记录结束后，行灌注、固定、取材及后固定、脱水后，将大鼠脊髓第七胸段、第八胸段、第九胸段连续横切面冰冻切片，进行Luxol fast blue染色，物镜放大2.5倍，用Leica正置显微镜采图，观察记录电极插入的节段、插入深度，确认记录电极尖端位于皮质脊髓束内。

1.7 放电信号的分析处理

利用神经信号分析软件Offline Sorter、Neuroex-plorer对已存储的信号文件进行波形特点的描述，包括波长、波幅、放电频率、同一电极上记录到的不同放电单元之间的同步性、两根电极上记录到的不同放电单元之间的同步性、放电信号的峰间期分析等。

2 结果

2.1 皮质脊髓束自发放电的稳定记录

长时间稳定记录到皮质脊髓束的自发放电，记录时间大于60min。剪断电极下游脊髓状态下，记录窗口显示的信号波形与正常记录状态下无明显区别。剪断电极上游脊髓状态下，记录窗口显示的只有基线信号，而放电信号波形已消失(图1)

Fig.1 Recording of electrophysiological signals from CST

2.2 对采集信号的直观描述

记录到的放电波形为多个放电单位具有不同波幅的波形叠加，放电频率高，呈连续阵发性，叠加的波形为先负后正一种形式，波宽为0.6～1.3 ms，波幅为-230～130μV。利用软件作波形扫描图，可见同一通道(同一根电极)采集到的较为清晰的电信号波形扫描图(图2)。

Fig.2 Scanogram of signals in one tunnel(10ms)

2.3 利用Neuro Explorer和Offline Sorter软件对长时间稳定记录到的波形文件进行进一步分析的结果

利用Neuro Explorer神经信号分析软件对记录的文件作放电频率分析，时间窗为2 s(每2 s为一计数单位)作频率直方图，可见在200s的采集记录过程中两个通道各4个放电单位的放电频率变化。各放电单位的放电频率最高值为40times/s(阵发放状态)，其他放电单位均＜1 time/s，呈簇性发放(图3)。

Fig.3 Frequency histogram of each unit in two tunnels(t=200s，bin=2 s)

利用Neuro Explorer神经信号分析软件对记录的文件作放电信号峰间期(ISI)分析，时间窗设为1 ms。可见在200s的采集记录过程中两个通道各4个放电单位的ISI变化。各放电单位的ISI最小值为3 ms，各放电单位最大放电频率的ISI值≥20ms，即各放电单位的不应期主要集中在20ms左右(图4)，远大于区分是否来自不同的放电单位的ISI≥3 ms的标准[3]，说明采集到的放电波形来自各不相同的放电单位(神经元)。

Fig.4 ISIH of each unit in two tunnels(bin=1 ms)

对不同通道和同一通道内不同放电单位的自发放电，通过做脉冲扫描(Raster)，观察放电的同步性(图5、图6)。可从图中看出，同时记录的不同放电通道的自发放电存在一定的同步性，表明信号之间存在部分的功能相关;同一通道内不同放电单位的自发放电存在很明显的同步性，表明同一记录电极记录到的自发放电信号来自大脑皮层同一功能区，定位于某一特定功能[4，5]。

Fig.5 Raster of each tunnel(arrows point at synch pulses)

Fig.6 Raster of each unit in two tunnels(arrows point at synch pulses)

3 讨论

随着研究方法的进步，人们对皮质脊髓束的结构和功能不断有新的认识，相关研究至今仍是神经科学领域的研究热点。为了对SCI病人进行更好的治疗，对有关皮质脊髓束的临床前期研究，如有关皮质脊髓束传导的神经信号特点、应用微电子技术重建脊髓功能等，这都需要对皮质脊髓束进行形态学定位和功能定位，需要建立一套能长期稳定地记录采集皮质脊髓束神经电信号并对其特性加以分析的方法。本实验采用Cerebus神经信号采集处理系统，利用记录电极可在大鼠的皮质脊髓束内较长时间记录到百万数量级较为稳定的微伏级神经电信号，实验结果理想。利用神经信号分析软件Offline Sorter和Neuroexplorer对电信号进行了分析，取得了较直观的实验结果。

正常记录和剪断电极下游脊髓状态下记录的波形、放电频率无明显差异，而剪断电极上游脊髓状态下记录不到放电信号，结合电极的定位，提示实验所采集记录到的放电信号来自皮质脊髓束。信噪比(SNR)是衡量记录神经电信号实验效果的重要指标，神经电信号幅度有大有小，而系统干扰信号控制得越小，SNR值也就越大，表明记录到的神经电信号越纯净。本研究在多次实验中均取得了很高的SNR值(2.88～11.75)，实验平台是成功有效的，实验所采集记录的神经电信号数据是可信的。

波形扫描图直观再现在整个记录时段同一通道(记录电极)上所有的信号波形，通过拉开时间坐标，可以清楚地观察到一个个神经信号波形的波长和波幅。本研究所采集记录的神经信号波形的波长均＞600μs，远大于锥体细胞放电信号波长 ＞270μs的判断标准[6]，表明所采集记录的神经电信号可能是由锥体细胞发放的。脉冲扫描图不包含信号波形信息，它体现在整个记录时段同一通道(记录电极)上神经信号发放密度(节律)，也可将在同一通道记录的多个单元信号分离为多个不同放电单位的脉冲扫描图，分别体现各放电单位的神经信号发放密度(节律)。

频率直方图描述通道各放电单位在整个记录时段的放电频率变化。本实验观察到放电单位的放电频率最高值为40times/s，呈爆发性发放，多数放电单位的放电频率＜1 time/s，呈簇性发放。

放电信号峰间期(ISI)分析通过作ISI直方图(ISIH)来进行。ISI描述神经信号相邻波峰之间的间隔时间，反映了神经信号发放的频率稳定性即信号发放的规律性。ISI相对集中，表明神经信号的发放较有规律，ISI分布分散，表明神经信号的发放呈无规律性。ISIH描述通道各放电单位在整个记录时段的ISI。ISI的数值可作为判断同一通道多组分信号分离为多个不同放电单位电信号的准确性[7]。本研究所作的ISI分析，各放电单位的ISI最小值为3 ms，最大值≥20ms，即各放电单位的不应期主要集中在20ms左右。远大于区分是否来自不同的放电单位的ISI≥3 ms的标准，表明采集到的放电波形确实来自不同的放电单位(神经元)[8]。

对不同放电通道和同一通道内不同放电单位的自发放电的同步性分析，通过作脉冲扫描(Raster)图进行。本研究从Raster图中看出，同时记录的不同放电通道的自发放电存在一定的同步性，表明信号之间存在部分的功能相关;同一通道内不同放电单位的自发放电存在很明显的同步性，表明同一记录电极记录到的自发放电信号来自大脑皮层同一功能区，定位于某一特定功能，而且各放电单位存在一定的协同性[9]。

本研究进行的皮质脊髓束电生理信号的采集记录，分析描述电信号的特征，为通过植入式微电极阵列采集记录电信号的方法建立了一定的实验基础，为将来进一步研究脊髓损伤修复与功能重建提供了有价值的神经电生理基础资料。

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